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      唐古特紅景天舒張SD大鼠肺小動脈的活性部位及其作用機(jī)制*

      2016-04-18 01:05:30李更兄李占強(qiáng)蓋祥云南星梅扎西東主楊惠蓮靳國恩蘆殿香
      關(guān)鍵詞:唐古特小動脈紅景天

      李更兄,李占強(qiáng),蓋祥云,南星梅,扎西東主,楊惠蓮,靳國恩,吳 萍**,蘆殿香***

      (1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2.青海民族大學(xué)藥學(xué)院)

      唐古特紅景天舒張SD大鼠肺小動脈的活性部位及其作用機(jī)制*

      李更兄1,李占強(qiáng)1,蓋祥云2,南星梅1,扎西東主1,楊惠蓮1,靳國恩1,吳 萍1**,蘆殿香1***

      (1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2.青海民族大學(xué)藥學(xué)院)

      目的 研究唐古特紅景天舒張大鼠肺小動脈的活性部位及其作用機(jī)制。方法 利用大孔吸附樹脂制備唐古特紅景天95%乙醇提取物的不同洗脫流份(去離子水,30%乙醇,70%乙醇,95%乙醇)。采用大鼠肺小動脈血管環(huán)離體灌流技術(shù),篩選藥物舒血管作用的活性部位。制備內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮血管環(huán),驗(yàn)證活性部位舒血管作用的靶點(diǎn)。利用去甲腎上腺素(NE)及氯化鉀(KCl)預(yù)收縮血管環(huán),明確活性部位的舒血管作用與鈣通道的關(guān)系。利用左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、四乙基氯化銨(TEA)、氯化鋇(BaCl2)預(yù)處理血管環(huán),闡釋活性部位影響血管張力的機(jī)制。 結(jié)果 大孔吸附樹脂的70%乙醇洗脫流份是唐古特紅景天95%乙醇提取物舒張肺小動脈的活性部位?;钚圆课豢蓜┝恳蕾囆缘厥鎻埛涡用},其對內(nèi)皮完整血管環(huán)的作用強(qiáng)于對去內(nèi)皮血管環(huán)的作用,兩者比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。活性部位舒血管的作用與其抑制細(xì)胞膜受體門控性鈣通道有關(guān)。L-NAME、TEA、和BaCl2三種阻斷劑能夠不同程度地減弱活性部位對肺小動脈血管環(huán)的舒張作用。結(jié)論 唐古特紅景天舒血管作用的活性部位主要富集于大孔吸附樹脂70%乙醇洗脫物里,其舒血管的效應(yīng)主要作用于血管內(nèi)皮,且呈現(xiàn)劑量依賴性。唐古特紅景天舒張大鼠肺小動脈的可能作用機(jī)制:1、通過抑制細(xì)胞膜受體門控性鈣通道,減少Ca2+流入血管平滑肌細(xì)胞引起血管舒張;2、作用于肺小動脈內(nèi)皮,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)至平滑肌使平滑肌舒張;3、作用于肺小動脈平滑肌的鉀離子通道,促進(jìn)通道開放引起血管平滑肌舒張。

      唐古特紅景天 活性 部位 血管 舒張 作用 機(jī)制

      課題組前期利用低壓氧艙模擬海拔4,500 m的高原低氧環(huán)境,研究了唐古特紅景天對低氧環(huán)境下大鼠肺動脈高壓形成的干預(yù)作用。我們發(fā)現(xiàn),唐古特紅景天具有一定的降低低氧性肺動脈高壓及逆轉(zhuǎn)低氧性肺血管重構(gòu)的作用[1]。我們也發(fā)現(xiàn),唐古特紅景天干預(yù)低氧性肺動脈高壓的機(jī)制與其舒張肺小動脈的作用有關(guān),其舒血管活性成分主要富集于95%乙醇提取物。為了明確唐古特紅景天95%乙醇提取物舒張肺小動脈作用的活性部位及其作用機(jī)制,本研究利用大孔吸附樹脂制備了唐古特紅景天95%乙醇提取物的四種洗脫流份(去離子水,30%乙醇,70%乙醇,95%乙醇),利用去甲腎上腺素或氯化鉀預(yù)收縮大鼠離體肺小動脈血管環(huán) ,進(jìn)一步分析唐古特紅景天干預(yù)低氧性肺動脈高壓藥理作用的活性部位,并分析其作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(陜)2012-003,購于西安交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,體質(zhì)量(250±20)g,大鼠自由進(jìn)食飲水]。唐古特紅景天{青海省玉樹州治多縣藏醫(yī)院,由青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院張得鈞教授鑒定,為景天科植物唐古特紅景天[Rhodiolaalgida(Ledeb.)Fu var.tangutica( Maxim.) Fu的干燥根]}。重酒石酸去甲腎上腺素注射液(Norephinephrine,NE,國藥準(zhǔn)字H12020621,天津金耀氨基酸有限公司),乙酰膽堿Ach(Acetylcholine,Sigma),N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(L-NAME,批號:101150336,Sigma),四乙基氯化銨(TEA,批號:28460,貨號:1040692,Sigma),氯化鋇(BaCL2,批號:1001900129,Sigma),Krebs-Henseleit(K-H)液(氯化鈉118、氯化鉀4.7、氯化鈣2.5、硫酸鎂1.2、磷酸二氫鉀1.2、碳酸氫鈉25、葡萄糖11.1 mmol·L-1、pH=7.4,無機(jī)鹽試劑均為市售分析純試劑)。RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),Alpha 1-2 plus型冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司),張力傳感器(JH-2,中國北京航空醫(yī)學(xué)研究所),BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 唐古特紅景天經(jīng)大孔吸附樹脂后的不同洗脫流份的制備

      取100 g唐古特紅景天,剪成小塊,用95%乙醇回流提取3次,每次提取1 h,收集提取液,減壓濃縮至無乙醇味,加去離子水混懸,經(jīng)D101大孔吸附樹脂吸附,用去離子水、30%乙醇/水溶液、70%乙醇/水溶液、95%乙醇/水溶液洗脫5個柱床體積,分別收集各流份,減壓濃縮并經(jīng)冷凍干燥,得到各流份干燥粉末,置于真空干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 大鼠肺小動脈血管環(huán)的分離及離體血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)

      20%烏拉坦腹腔注射(0.5mL/0.1kg)麻醉大鼠,仰臥固定,打開胸腔,將心肺快速取出,置于氧飽和的、冰浴的KH液中。剪下肺葉(左肺上葉),用大頭針固定肺葉于冰浴的KH液中??焖兮g性分離2~3級肺動脈,分離過程中避免牽拉肺動脈,盡量保持動脈環(huán)完整。隨后將分離的肺小動脈剪成平均長度為2 mm的血管環(huán)。

      將肺動脈環(huán)固定在上下兩根三角形掛鉤上,其中一個掛鉤連接張力傳感器,另外一個掛鉤下端固定在通氣桿上。實(shí)驗(yàn)期間,血管環(huán)被浸泡在含有10 mL KH液的組織浴槽內(nèi),期間持續(xù)通入混合氣體(95%O2+5%CO2),并保持37 ℃恒溫。血管環(huán)被給予300~400 mg基礎(chǔ)張力,并在此環(huán)境下平衡約120分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。平衡期間每隔15分鐘將組織浴槽內(nèi)的KH液更換為新鮮的氧飽和的37 ℃ KH液。血管的張力變化通過張力傳感器輸入信號采集系統(tǒng),最后呈現(xiàn)并記錄在計算機(jī)上。舒張率=(藥物引發(fā)的張力)/1 μmol·L-1NE引發(fā)的張力)×100%。實(shí)驗(yàn)需要去除血管環(huán)內(nèi)皮時,用細(xì)鋼絲穿入肺動脈環(huán)內(nèi),輕柔摩擦肺動脈環(huán)。檢驗(yàn)血管環(huán)內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮方法:待血管張力平衡后,加入1 μmol·L-1NE,待張力升高至最大并穩(wěn)定后,加入Ach(10μmol·L-1),當(dāng)舒張率大于80%時,表示內(nèi)皮完整,舒張率小于30%認(rèn)為血管內(nèi)皮已去除。

      1.2.3 唐古特紅景天舒血管作用活性部位的篩選及其作用機(jī)制研究

      肺動脈環(huán)調(diào)至基礎(chǔ)張力后,平衡至最佳狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,向浴槽內(nèi)加入NE(1μmol·L-1),待肺動脈收縮達(dá)到最大值并進(jìn)入平臺期后,向浴槽內(nèi)累積加入唐古特紅景天經(jīng)大孔吸附樹脂后的不同洗脫流份(0.38~1.9mg/mL),對照組累積加入相同體積的KH液,觀察藥物對NE預(yù)收縮肺動脈張力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用新鮮的氧飽和的37 ℃的KH液連續(xù)沖洗三次,直至血管環(huán)的張力恢復(fù)至基礎(chǔ)張力。再向浴槽內(nèi)加入NE(1μmol/L),以觀察活性部位作用于血管環(huán)之后對其活性是否有影響。

      阻斷劑對活性部位舒張NE預(yù)收縮大鼠離體肺動脈的影響的實(shí)驗(yàn)方法如下:將肺動脈調(diào)整至基礎(chǔ)張力,并平衡至最佳狀態(tài),向組織浴槽內(nèi)加入NE(1μmol/L),待血管環(huán)收縮至最大值,并且出現(xiàn)平臺期之后,分別加入L-NAME(100μmol·L-1)、TEA(1 mmol·L-1)、BaCL2(1mmol·L-1),對照組加入相同體積的KH液,待新的平臺期出現(xiàn)后,再向各個組織浴槽內(nèi)累積加入活性部位藥液(0.38~1.9mg/mL),觀察張力變化。

      1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

      2 結(jié)果

      2.1 唐古特紅景天95%乙醇提取物舒血管作用的活性部位篩選結(jié)果(表1)

      研究發(fā)現(xiàn),大孔吸附樹脂各洗脫流份中,95%乙醇洗脫物收率不足1%,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該部位活性表現(xiàn)不佳,故未進(jìn)行該流份的后續(xù)研究。與30%乙醇洗脫流份相比,70%乙醇洗脫流份對NE預(yù)收縮肺小動脈的舒張作用更強(qiáng),兩者比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明70%乙醇洗脫流份是唐古特紅景天95%乙醇提取物舒血管作用的活性部位。去離子水洗脫流份在同一濃度下未顯示舒血管效應(yīng)。相反,我們發(fā)現(xiàn)該洗脫流份呈現(xiàn)縮血管的作用,其具體的藥理作用有待深入研究。

      Table 1 comparison of 70% and 30% ethanol eluting part induced relaxing effects on NE pre-contracted intact endothelium rings

      2.2 活性部位對NE預(yù)收縮內(nèi)皮完整、去內(nèi)皮肺小動脈的影響結(jié)果(圖1,表2)

      結(jié)果顯示,活性部位誘導(dǎo)的劑量依賴性的舒張作用,在內(nèi)皮完整和內(nèi)皮去除的肺小動脈環(huán)中均可以觀察到,但是活性部位對內(nèi)皮完整的肺小動脈環(huán)的最大舒張率顯著高于內(nèi)皮去除的肺小動脈環(huán),說明活性部位舒張肺小動脈的作用一部分是由于其作用于血管內(nèi)皮,另一部分是其對肺小動脈平滑肌的直接舒張作用所致。我們也發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用新鮮的氧飽和的37℃ KH液洗脫血管環(huán)至基礎(chǔ)張力,再向組織浴槽內(nèi)加入NE檢驗(yàn)血管活性,血管最大收縮率仍然大于100%,且出現(xiàn)平臺期,證明活性部位作用于內(nèi)皮完整的、去內(nèi)皮的肺小動脈血管環(huán)后,血管活性良好,該結(jié)果也在一定程度上說明了藥物活性部位對血管環(huán)無毒性作用。

      NE:去甲腎上腺素 Ach:乙酰膽堿

      圖1 活性部位(THT)對NE預(yù)收縮去內(nèi)皮(A)和內(nèi)皮完整(B)肺小動脈舒張作用的代表圖

      Figure 1 Representative curve of active part induced relaxing effects on NE pre-contracted endothelium-denuded
      (A)and intact endothelium(B)rings

      Table 2 Comparison of active part induced relaxing effects on NE pre-contracted endothelium-denuded and intact endothelium rings

      2.3 活性部位對NE與KCL預(yù)收縮血管環(huán)作用的比較結(jié)果(表3)

      研究發(fā)現(xiàn),藥物活性部位對NE預(yù)收縮的肺小動脈血管環(huán)具有劑量依賴性的舒張作用,而對KCL預(yù)收縮的肺小動脈血管環(huán)的舒張作用較弱,兩者作用相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      組別n藥物濃度(mg/mL)0.380.761.141.521.90NE組311.01±0.5636.28±2.8570.89±1.1989.18±2.9294.88±0.41KCL組30.004.67±0.839.51±2.2315.39±1.1643.49±2.55t34.01818.43941.97240.78534.473P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

      2.4 活性部位對NE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用與NO及鉀離子通道的關(guān)系(表4)

      研究發(fā)現(xiàn),活性部位對NE預(yù)收縮肺小動脈血管環(huán)的舒張作用能夠被L-NAME、TEA、BaCL2不同程度地阻斷,三組的最大舒張率分別為62.74±5.44、76.08±4.34、58.36±6.19,低于活性部位對照組的最大舒張率(94.88±0.41,P<0.05)。

      組別n藥物濃度(mg/mL)0.380.761.141.521.90活性部位組311.01±0.5636.28±2.8570.89±1.1989.18±2.9294.88±0.41L-NAME組46.27±2.51?▲21.23±5.20?*40.69±8.43?51.11±5.98?*62.74±5.44?*TEA組44.04±0.87?▲13.70±3.82?31.46±4.31?62.33±8.36?▲76.08±4.34?▲BaCl2組310.71±3.3019.54±2.61?34.54±7.92?41.00±7.58?58.36±6.19?F 9.317 19.580 28.476 29.503 37.969P 0.003 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

      注:*表示與活性部位組比較P<0.05;▲表示與BaCl2組比較P<0.05;*表示與TEA組比較P<0.05.

      3 討論

      本研究發(fā)現(xiàn),唐古特紅景天95%乙醇提取物舒張大鼠肺小動脈的活性部位主要富集于大孔吸附樹脂的70%乙醇洗脫流份。活性部位能夠誘導(dǎo)NE預(yù)收縮的大鼠離體肺小動脈呈現(xiàn)劑量依賴性舒張現(xiàn)象,其作用部分基于內(nèi)皮,部分基于肺小動脈平滑肌,并且對血管環(huán)無毒性作用。

      血管張力的維持主要受血管平滑肌的收縮和內(nèi)皮依賴性舒張兩者的動態(tài)調(diào)控。細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放所產(chǎn)生的Ca2+,在血管平滑肌的收縮中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞膜上的受體門控性鈣通道、電壓門控性鈣通道在調(diào)控細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流中起主要作用?;钚圆课粚E預(yù)收縮的肺小動脈血管環(huán)具有劑量依賴性的舒張作用,但對KC1預(yù)收縮的血管環(huán)的作用較弱,說明這種舒張作用與抑制受體門控性鈣通道的作用有關(guān),與抑制電壓門控性鈣通道的關(guān)系較小[2-3]。

      內(nèi)皮細(xì)胞可分泌內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子,研究認(rèn)為其化學(xué)本質(zhì)是一氧化氮(NO)[4-5]。NO由左旋精氨酸(L-arginine,L-Arg) 經(jīng)一樣化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)代謝產(chǎn)生后迅速進(jìn)入平滑肌細(xì)胞,繼而催化GTP向cGMP轉(zhuǎn)化。cGMP濃度的升高可激活蛋白激酶G(PKG),活化的PKG阻礙細(xì)胞Ca2+的內(nèi)流并降低血管平滑肌對Ca2+的敏感性,最終引起平滑肌松弛。L-NAME作為內(nèi)皮NO合酶(eNOS)抑制劑, 可有效地抑制NO的生成。我們的研究發(fā)現(xiàn),L-NAME能夠阻斷活性部位舒張大鼠離體肺小動脈的作用,說明NO在活性部位舒張肺小動脈的作用中占有重要地位?;钚圆课豢赡艽龠M(jìn)了肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞的L-Arg產(chǎn)生NO,繼而產(chǎn)生舒張平滑肌的作用。在研究鉀離子通道阻斷劑對活性部位舒張肺小動脈的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),大電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道(BKCa)和內(nèi)向整流鉀離子通道(KIR)阻斷劑(TEA和BaCL2)能夠不同程度地阻斷活性部位對大鼠肺小動脈的舒張作用,說明活性部位可能促進(jìn)了鉀通道的開放,從而引起血管平滑肌的舒張[6]。根據(jù)文獻(xiàn)報道,NO-cGMP通路在內(nèi)皮依賴性的血管舒張中占主要地位,NO誘導(dǎo)的血管舒張作用部分依賴于cGMP、PKG介導(dǎo)的大電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道(BKCa)的活化。因此我們推測,活性部位誘導(dǎo)的大鼠肺小動脈的舒張作用可能是通過作用于NO-cGMP-PKG- BKCa通路,引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平下降而導(dǎo)致血管發(fā)生舒張[7]。

      本研究發(fā)現(xiàn),唐古特紅景天95%乙醇提取物的大孔樹脂去離子水洗脫流份顯示出縮血管的效應(yīng),我們推測該流份可能減弱了唐古特紅景天在整體動物水平對低氧性肺血管收縮和重構(gòu)的干預(yù)作用,課題組近期的工作正在驗(yàn)證該縮血管流份的藥理作用及其相關(guān)的作用機(jī)制。

      [1]蘆殿榮,張樹娜,靳國恩,等.唐古特紅景天降低大鼠低氧性肺小動脈高壓的作用及對ET-l,eNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響[J].實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):274-279.

      [2]VS Alfredo Augusto,F(xiàn)JBD Lima,TSD Brito,et al.Vasorelaxation induced by methyl cinnamate,the major constituent of the essential oil of Ocimum micranthum,in rat isolated aorta[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2014,41(10):755-762.

      [3]YY Tian,Y Yu,J Yu,et al.Vasodilatory Effect of a Novel Rho-Kinase Inhibitor,DL0805-2,on the rat Mesenteric Artery and its Potential Mechanisms[J].Cardiovascular Drugs and Therapy.2014,28(5):415-424.

      [4]G Santulli,H Domínguez,R Lucas,et al.The new nitric oxide donor cyclohexane nitrate induces vasorelaxation,hypotension,and antihypertensive effects via NO/cGMP/PKG pathway[J].Frontiers in Physiology,2015,1(6):1-9.

      [5]SZ Mao,L Hong,HU Liang-Gang,et al.Effect of apelin on hypoxic pulmonary hypertension in rats:role of The NO pathway[J].Sheng li xue bao[Acta physiologica Sinica],2009,61(5):480-484.

      [6]Protic Dragana,R Nebojsa,S Svetlana,et al.The Role of Potassium Channels in the Vasodilatation Induced by Resveratrol and Naringenin in Isolated Human Umbilical Vein[J].Drug Development Research,2015,76(1):17-23.

      [7]XY Gai,YH Wei,W Zhang,et al.Echinacoside induces rat pulmonary artery vasorelaxation by opening The NO-cGMP-PKG-BKCa channels and reducing intracellular Ca2+levels[J].Acta Pharmacologica Sinica,2015,36(5):587-596.

      Active part of rhodiola algidavar.Tanguticaon vasorelaxation of rat pulmonary artery

      Li Gengxiong1,Li Zhanqiang1,Gai Xiangyun2,Nan Xingmei1,Zhaxi Dongzhu1

      (1.Medical College of Qinghai University;2. Pharmaceutical college of Qinghai Nationalities University)

      Objective To investigate the active part of traditional Tibetan herb Rhodiola algida var.tangutica on inducing rat pulmonary artery vasorelaxatioan.Methods To prepare different eluting part of 95% ethanol extract of traditional Tibetan herb Rhodiola algida var.tangutica by macroporous adsorptive resins(deionized water,30% ethanol,70% ethanol and 95% ethanol).Vascular ring perfusion method invitrowas used to detect the active part and its mechanism concerning vascular endothelium,NO,calcium and potassium ion channels.Results The active part was accumulated in 70% ethanol eluting part of 95% ethanol extract of traditional Tibetan herb Rhodiola algidavar.Tangutica,which showed inducing effect on rat pulmonary artery vasorelaxation.The effect of active part on noradrenaline pre-contracted intact endothelium and endothelium-denuded rings showed significant difference.The effect of active part on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of on KCL.And the effect of pulmonary artery vasorelaxatioan was inhibited by adding L-NAME,TEA and BaCl2.Conclusions The active part is mainly accumulated in eluting part of 70% ethanol extract.The effect of active part is based on vascular endothelium and showed dose dependent manner.The mechanism was included as follows:1.The vasorelaxatioan effect is based on inhibiting receptor-operated calcium channel which reducing intracellular Ca2+levels;2.The active part can increase NO concentration by influencing pulmonary artery endothelium which plays a role in inducing pulmonary artery vasorelaxation;3.The active part can induce vasorelaxation by opening the potassium ion channels which reducing intracellular Ca2+levels.

      Rhodiola algidavar.TanguticaActive Part Vessel Vasorelaxation Mechanism

      *:青海省科技廳自然科學(xué)基金面上項目(2014-ZJ-915);青海省科技廳自然科學(xué)基金青年項目(2015-ZJ-928Q);國家自然科學(xué)基金(81160243);青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項目(2014-Z-Y-07) 李更兄(1990~),女,漢族,青海籍,在讀碩士研究生.**:通訊作者,教授,wupingyixue@163.com;***:通訊作者,教授,ludianxiang@qhu.edu.cn

      R96

      A

      10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.011

      2015-10-03

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      西夏研究(2017年1期)2017-07-10 08:16:55
      血清胱抑素C與小動脈閉塞型卒中的關(guān)系
      紅景天及紅景天苷對高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用
      3種紅景天藥效學(xué)比較研究
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