節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏，曾向萍，嚴(yán)婉榮，陳綿才，趙志祥＊，芮 凱

（1．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，海南?？?71100；2．海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71100）

節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏1，2，曾向萍1，2，嚴(yán)婉榮1，2，陳綿才1，2，趙志祥1，2＊，芮 凱1，2

（1．海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，海南?？?71100；2．海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口571100）

為了對海南瓜類蔬菜炭疽病菌的抗性監(jiān)測研究及抗性治理提供理論依據(jù)，對海南不同市縣采集的節(jié)瓜炭疽病病樣中分離純化的90株炭疽病原菌進(jìn)行了檢測，采用菌絲生長速率法測定2種病原菌對嘧菌酯的敏感性。結(jié)果表明：經(jīng)分生孢子形態(tài)鑒定節(jié)瓜炭疽病有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．a(chǎn)cutatum），膠孢炭疽菌為優(yōu)勢種群，占84．4%；2種病原菌對嘧菌酯的EC50在0．334 4～36．467 0μg／mL，平均為12．954 4μg／mL，敏感性分布接近于正態(tài)分布，EC50值之間表現(xiàn)較連續(xù)，故以平均EC50值為敏感性基線，用于節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的田間抗藥性監(jiān)測。嘧菌酯與多菌靈、福美雙、丙環(huán)唑和咪鮮胺不存在交互抗性。

節(jié)瓜；炭疽病菌；嘧菌酯；敏感性；交互抗性

節(jié)瓜屬葫蘆科一年生攀援草本植物，是冬瓜的一個變種，形體從短圓柱形到長圓柱形，原產(chǎn)我國南部，是我國的特種蔬菜之一，在廣東、廣西、臺灣已有多年栽培歷史。節(jié)瓜具有清熱、清暑、解毒、利尿、消腫等功效，是炎熱夏季的理想蔬菜，其含鈉和脂肪都低，常吃可起到減肥的作用。炭疽?。ˋnthracnose）是葫蘆科瓜類蔬菜生產(chǎn)上的重要病害之一，也是節(jié)瓜的重要病害，種植地常發(fā)生。發(fā)病時常造成幼苗猝倒，成株莖、葉枯死及瓜果腐爛，有時癥狀會混合發(fā)生，危害嚴(yán)重。

生產(chǎn)中炭疽病主要以化學(xué)防治為主，常用的藥劑有福美雙、百菌清、多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑等［1－2］，而在海南常使用嘧菌酯作為防治藥劑。嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是一類能有效控制子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌危害的廣譜性殺菌劑［3］。與苯并咪唑類、苯酰胺類、二甲亞胺類及DMI類殺菌劑無交互抗藥性，在全世界被普遍使用。由于嘧菌酯作用位點(diǎn)單一，并且作用的靶標(biāo)自發(fā)突變的頻率較高，在高選擇壓力下，病原菌很容易產(chǎn)生抗藥性的群體［4］。國內(nèi)對西瓜、黃瓜、辣椒、芒果、柑橘炭疽病的研究多側(cè)重于病害的發(fā)生識別、規(guī)律、藥劑的室內(nèi)毒力測定及化學(xué)藥劑的防治方面［5－9］。黃樹生等［10］通過田間試驗(yàn)比較啶氧菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、苯甲嘧菌酯5種藥劑對西瓜炭疽病的控制效果，唐爽爽等［11］和胡育海等［12］進(jìn)行了幾種殺菌劑對西瓜炭疽病菌的毒力測定或配比試驗(yàn)，張令宏等［13］研究23種殺菌劑對8株抗多菌靈的芒果炭疽病菌的室內(nèi)毒力及其交互抗性，楊葉等［14］對海南23株芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性進(jìn)行了測定，詹儒林等［15］研究了來自廣東和海南的芒果炭疽病菌對多菌靈的抗藥性，但相關(guān)研究中節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性及相關(guān)性研究未見報道。因此，筆者通過生長速率法研究了海南節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性基線及其4種不同類型常用殺菌劑的交互抗性，為海南瓜類蔬菜炭疽病菌的抗性監(jiān)測研究及抗性治理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1試驗(yàn)材料

藥劑：95%嘧菌酯原藥，98．4%多菌靈原藥，96%福美雙原藥，97．8%丙環(huán)唑原藥，96%咪鮮胺原藥，以上5種原藥均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

試驗(yàn)用化學(xué)試劑：99%水楊肟酸、甲醇、丙酮、鹽酸均為市售品。

PDA培養(yǎng)基：土豆200g，葡萄糖20g、瓊脂粉20g，蒸餾水1 000mL，pH自然。

1．2病害樣本采集、分離和鑒定

2013年從海南省?？?、澄邁、定安、臨高4市縣節(jié)瓜種植地采集未施用過嘧菌酯的炭疽病病樣，經(jīng)過常規(guī)組織分離［16］、純化、鑒定，并將純化的菌株保存于4℃冰箱中備用。

1．3炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性測定

嘧菌酯濃度設(shè)為0、0．01μg／mL、0．1μg／mL、1μg／mL、10μg／mL和100μg／mL，先用甲醇溶解嘧菌酯原藥，配制成1×104μg／mL的貯液待用，然后再配成所需濃度的平板，99%水楊肟酸溶于甲醇，配制成100μg／mL濃度的平板，以加水楊肟酸不加藥為對照，每個處理3次重復(fù)。將待測的菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5d，用無菌打孔器從菌落邊緣打取直徑5mm的菌塊，用接種針挑取菌塊，菌絲面朝下接種在培養(yǎng)基平板中央，培養(yǎng)皿直徑90mm，每皿接1個菌塊，每處理3皿。28℃培養(yǎng)7d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。計(jì)算生長抑制率，采用機(jī)率值分析法計(jì)算藥劑對靶標(biāo)菌菌絲的有效抑制濃度，根據(jù)抑制率計(jì)算其EC50值。

抑制率＝［1－（處理菌落直徑－5）／（對照菌落生長直徑－5）］×100%［17］

1．4嘧菌酯與不同殺菌劑的交互抗藥性測定

用嘧菌酯的4個相對敏感和4個相對抗性的菌株，采用菌絲生長速率法，分別測定其對多菌靈、丙環(huán)唑、咪鮮胺和福美雙的敏感性。

1．5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，求出毒力回歸方程y＝bx＋a及其各藥劑的EC50（μg／mL）和相關(guān)系數(shù)，然后進(jìn)行鄧肯氏差異性顯著分析。

2結(jié)果與分析

2．1病原種群類型

共分離純化獲得90株炭疽菌，經(jīng)分生孢子形態(tài)鑒定，有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．a(chǎn)cutatum）2種（圖1），其中膠孢炭疽菌有76株，尖孢炭疽有14株，以膠孢炭疽為主，數(shù)量是總菌株的84．4%，為優(yōu)勢種群（表）。

圖1 2種炭疽菌菌株的分生孢子形態(tài)Fig．1 Conidium morphology of two C．orbiculare strains

表 海南節(jié)瓜炭疽病菌種類Table Types of C．orbicularein zucchini in Hainan

2．2節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性

對90株炭疽菌進(jìn)行敏感性測定，其EC50最大、最小和平均值分別為0．334 4μg／mL、36．467 0μg／mL和12．954 4μg／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為8．027 4，最大值是最小值的109．05倍。在SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件中對EC50值進(jìn)行單樣本K－S正態(tài)性分布檢驗(yàn)，得Kolmogorov－Smimov Z＝1．133，漸進(jìn)連續(xù)性P＝0．153＞0．05，檢驗(yàn)分布為正態(tài)分布，EC50值表現(xiàn)連續(xù)性。因此，平均EC50值（12．954 4±8．027 4）μg／mL，可作為節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性基線（圖2），用于節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的田間抗藥性監(jiān)測。

2．3嘧菌酯與不同殺菌劑間的交互抗性

從圖3敏感性的相關(guān)結(jié)果可見，嘧菌酯與多菌靈、丙環(huán)唑、咪鮮胺和福美雙4試驗(yàn)藥劑的相關(guān)系數(shù)分別為0．341 9、0．023 6、0．501 1和0．027 7。對其EC50值進(jìn)行線性回歸分析得出，嘧菌酯與上述4種藥劑無顯著相關(guān)性，說明嘧菌酯與這4種藥劑之間不存在交互抗性。

圖2 節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性頻率分布Fig．2 Frequency distribution of sensitivity of C．orbiculare to Azoxystrobin

圖3 嘧菌酯與不同類型殺菌劑的交互抗性Fig．3 Cross－resistance between Azoxystrobin and other four fungicides

3結(jié)論與討論

1）節(jié)瓜上采集到的炭疽病菌有膠孢炭疽和尖孢炭疽兩種，膠孢炭疽菌為優(yōu)勢種群。未分離到瓜類炭疽菌，而王會芳等［18］報道，2010年在海南苦瓜上分離鑒定到瓜類炭疽菌［Colletotrichum oribiculared（Berk．Mont）Arx］，這可能與采集的樣本有關(guān)，而是否還有其他的病原菌種類，還有待于進(jìn)一步監(jiān)測。

2）李紅霞等［4］在江蘇海南采集到45株辣椒炭疽菌和膠孢炭疽菌，采用孢子萌發(fā)法測定2種菌對嘧菌酯的敏感性為（0．047±0．040）μg／mL，同時認(rèn)為采用孢子萌發(fā)法比菌落直徑法測定辣椒炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性更為科學(xué)，而本研究采用生長速率法測定采集到的2種炭疽菌對嘧菌酯的敏感性較高，這可能與采集地區(qū)、作物品種、使用方法、病原菌種類及當(dāng)?shù)赜盟帤v史不同有關(guān)，而對于節(jié)瓜炭疽病菌來說，哪種方法更為科學(xué)簡便，還有待于研究。

3）海南種植節(jié)瓜面積逐年增大，發(fā)病率一般為10%～30%，嚴(yán)重時達(dá)70%～80%，輕則造成減產(chǎn)，影響品質(zhì)，重則造成巨大損失。多菌靈、丙環(huán)唑、咪鮮胺和福美雙是與嘧菌酯不同類型的殺菌劑，分屬苯并咪唑類、三唑類、咪唑類和二硫代氨基酸鹽類，不同殺菌劑作用方式、作用位點(diǎn)等的不同，抗藥性也不盡相同。本研究通過試驗(yàn)明確了嘧菌酯與多菌靈、丙環(huán)唑、咪鮮胺和福美雙之間無交互抗性。為了延緩該殺菌劑抗性的產(chǎn)生，可根據(jù)生產(chǎn)上病害發(fā)生情況采用不同作用機(jī)制的藥劑輪換使用。生產(chǎn)上高效、內(nèi)吸、選擇性強(qiáng)的殺菌劑被廣泛的應(yīng)用，其抗藥性越來越普遍和嚴(yán)重，使得化學(xué)防治失敗，生產(chǎn)遭受重大損失。筆者通過測定海南地區(qū)節(jié)瓜炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性，建立敏感性基線，通過早期監(jiān)測，提出科學(xué)的用藥方法，為抗性治理提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

Sensitivity of Colletotrichum orbiculareIsolated from Zucchini to Azoxystrobin and Cross－Resistance between Azoxystrobin and Other fungicides

X
IAO Min1，2，ZENG Xiangping1，2，YAN Wanrong1，2，CHEN Miacai1，2，ZHAO Zhixiang1，2＊，RUI Kai1，2
（1．Institute of Plant Protection，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan571100；2．Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests，Haikou，Hainan571100，China）

The sensitivity of 90 C．orbiculare strains isolated and purified from zucchini samples infected with C．gloeosporioides and C．a(chǎn)cutatumcollected from different cities（counties）in Hainan to Azoxystrobin by mycelial growth rate to provide the theoretical basis for resistance monitoring and management of melon vegetables against C．orbicularein Hainan．Results：There are C．gloeosporioides and C．a(chǎn)cutatumin anthracnose of zucchini according to identification of conidium morphology．C．gloeosporioides is a dominant species and accounts for 84．4%．EC50of C．gloeosporioides and C．a(chǎn)cutatum is 0．334 4～36．467 0μg／mL and their average EC50is 12．954 4μg／mL．The average EC50value is used as the sensitivity baseline because the sensitivity distribution is close to Gaussian distribution，which can be used to monitor resistance of C．orbiculare to Azoxystrobin in zucchini field．There is no cross－resistance between Azoxystrobin and Carbendazim，Thiram，Propiconazoie，Prochioraz respectively．

zucchini；Colletotrichum orbiculare；Azoxystrobin；sensitivity；cross－resistance

S436．429

A

1001－3601（2016）02－0071－0085－04

2015－05－02；2016－02－04修回

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)“農(nóng)作物重要病原菌抗藥性監(jiān)測及治理技術(shù)研究與示范”（201303023）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃“熱帶蔬菜主要病蟲害防控技術(shù)研究與集成示范”（2012BAD19B06－07）；海南省省屬科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(xiàng)“北運(yùn)瓜菜重大病蟲害抗藥性治理與農(nóng)藥殘留控制技術(shù)研究”（KYYS－2015－01）

肖 敏（1970－），女，副研究員，從事植物病理學(xué)和病害綜合防控技術(shù)研究。E－mail：xiaominnky＠21cn．com

＊通訊作者：趙志祥（1981－），男，副研究員，博士，從事植物病理學(xué)和微生物學(xué)研究。E－mail：zhaozhixiang0207＠126．com