中國月季感染白粉菌后的蛋白質和糖類含量變化

楊發(fā)忠，楊德強，楊 斌＊

（1．西南林業(yè)大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，中國昆明650224；2．云南師范大學信息學院，中國昆明650092）

中國月季感染白粉菌后的蛋白質和糖類含量變化

楊發(fā)忠1，楊德強2，楊 斌1＊

（1．西南林業(yè)大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，中國昆明650224；2．云南師范大學信息學院，中國昆明650092）

為了對寄主植物介導的間接病蟲互作機理研究奠定基礎，采用光度分析法研究白粉菌侵染中國月季植株對植物體內(nèi)糖類和蛋白質含量的影響。結果表明：中國月季（Rosa chinensis）感染白粉菌（Sphaerotheca pannosa）后，隨著感病時間的延長，蛋白質含量逐漸下降，而總糖含量則呈先升高后降低的趨勢；白粉菌侵染對中國月季葉片蛋白質和總糖含量的影響均存在明顯的時間效應，隨著感病程度增加，蛋白質和總糖的含量均明顯降低，蛋白質含量從73．52mg／g降低至59．92mg／g，總糖含量從17．84mg／g降低至8．94mg／g。

中國月季；白粉菌；總糖；蛋白質；病蟲互作關系；時間效應

1材料與方法

1．1材料

中國月季幼苗以及所需月季白粉菌均采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉種植基地種植中國月季的大棚中。

儀器有WTJ7200型分光光度計［尤尼柯（上海）儀器有限公司］，AL－204型電子天平［梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司］；試劑包括考馬斯亮藍G－250、葡萄糖、牛血清標準蛋白（bovine serum albumin，BSA）3種標準品，圴購自西格瑪公司（Sigma－Aldrich，St Louis，MO，USA）。

1．2月季栽培

將采回的健康無病蟲害的中國月季幼苗用基質在溫室中進行栽培，適時澆水、施肥及防治病蟲害。培育條件為27℃、70%RH、12h光周期。

1．3白粉菌接種及采樣

從采回的帶有白粉菌的中國月季葉片上用軟毛刷輕輕將孢子刷下，并用無菌水配制成混懸液，再用軟毛刷蘸取混懸液均勻刷在月季葉片上，置于光線充足、相對濕度90%、27℃、12h光周期條件下培養(yǎng)。以不接種的健康月季植株作對照，相同條件下培育于另一溫室中。

接種后的第8天、12天和16天，分別采集接種白粉菌后的中國月季葉片，洗凈、60℃干燥至恒重，－20℃冰箱中保存，用于測定葉片組織中總糖和蛋白質含量變化的時間效應。

另外，接種白粉菌時僅在定點位置接種，接種面積約為全葉面積的1／20。接種20d開始采樣，根據(jù)孢子覆蓋葉片面積占全葉面積的比例采集5種不同病級的中國月季葉片，1～5級表示孢子覆蓋面積占全葉面積的比例分別為1／16、1／8、1／4、1／2、1／1。采集的葉片同法洗凈、恒重、保存，用于測定總糖和蛋白質含量隨感病程度的變化。

1．4葉片蛋白質含量的測定

蛋白質含量測定參考Bradford［6］的方法稍有改動。標準曲線繪制：每組分別取不同體積BSA標準液（100μg／mL）探索最佳用量，在低（0．1～0．5μg／mL）、中（1～5μg／mL）、高（1～5μg／mL）3種濃度范圍內(nèi)繪制標準工作曲線，測定波長為595nm，均以蒸餾水為空白對照。選出較好的1條作為測定蛋白質的標準曲線。

葉片蛋白質含量測定：分別精密稱取300mg健康或感染白粉菌的葉片組織，加入1．5mL蒸餾水，4℃勻漿，在12 000r／min、4℃下冷凍離心20min，得上清液。吸取上清液0．1mL于試管中再加入0．1mL蒸餾水、加入5mL考馬斯亮藍G－250試劑，混勻，于25℃下放置2min，在595nm下測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算風干葉片中的蛋白質含量（mg／g）。每種不同種類的葉片重復6次取平均值。

1．5葉片可溶性糖含量測定

可溶性糖含量測定使用苯酚－硫酸法［7］。用葡萄糖作標準品繪制標準工作曲線。精密稱取健康或感染白粉菌的葉片組織500mg，加2mL蒸餾水常溫勻漿，加5mL 3mol／L H2SO4，80℃水浴加熱15min，12 000r／min離心20min，得上清液。取上清液1mL，加5%（wt／vol）的苯酚1mL和98%（wt／wt）的硫酸3mL，室溫放置10min，490nm測定吸光度A的值，根據(jù)標準工作曲線計算風干葉片中的總糖含量（mg／g）。每種樣品重復6次取平均值。

1．6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

蛋白質和總糖含量測定結果統(tǒng)計分析均用SPSS 21．0（IBM－SPSS，Chicago，IL，USA）中的T檢驗進行。

2結果與分析

2．1接種白粉菌后月季葉片的蛋白質含量及總糖含量

1）蛋白質含量。以BSA為標準品繪制蛋白質標準工作曲線，在低濃度范圍內(nèi)，所得回歸方程為A＝0．029 2 c－0．0062，R2＝0．802 6（其中，A為吸光度，c為BSA濃度，R為線性相關系數(shù)），回歸方程的線性關系較差；而在中等濃度范圍內(nèi)為A＝0．030 3 c＋0．026 6，R2＝0．999 3，回歸方程有很好的線性關系；在高濃度范圍內(nèi)為A＝0．010 5 c＋0．158 1，R2＝0．802 6，線性關系同樣很差。所以，應選擇中濃度范圍內(nèi)的標準工作曲線用于樣品測定。在吸光光度法測定過程中，如果濃度太高，會偏離朗伯－比爾定律，使測定結果誤差較大。濃度太高時，光路中處于后面的吸光點會被前面的吸光點擋住而未能正常吸光，所以一般引入負誤差。同樣濃度太低也會引入較大的誤差，此時儀器誤差可能超過由蛋白質本身引起的吸光度值的大小。從圖1看出，與健康葉片相比，感病8d后葉片內(nèi)蛋白質含量已經(jīng)下降，并隨感病時間延長而進一步降低，從73．96mg／g降低至62．92mg／g，差異達顯著水平（P＜0．05）。

圖1 中國月季接種白粉菌后不同時間葉片的蛋白質含量和總糖含量Fig．1 Leaf protein and carbohydrate content of R．chinensis plants inoculated with powdery mildew after different time

2）總糖含量。以葡萄糖作標準品、繪制苯酚－硫酸法測定的標準工作曲線，所得回歸方程為A＝0．010 6 c＋0．010 0，R2＝0．999 6（其中，A為吸光度，c為葡萄糖濃度，R為線性相關系數(shù)），線性關系良好，可滿足樣品含量測定要求。圖1結果表明，與健康中國月季葉片相比，感病8d后葉片內(nèi)總糖含量不但沒有下降，反而升高，盡管差異不顯著。但是后來隨感病時間延長而降低，從最高17．92mg／g（感菌8d后）降低至9．06mg／g，與蛋白質變化規(guī)律一致，差異也達顯著水平（P＜0．05）。綜合蛋白質和總糖測定結果可知，中國月季感染白粉菌8d后，植物體內(nèi)生理生化代謝也受到明顯影響，使蛋白質和總糖含量發(fā)生了變化。而且，當感病時間大于12d時，蛋白質和總糖的含量均明顯降低。

2．2不同感病程度月季葉片的蛋白質含量和總糖含量

1）蛋白質含量。從圖2看出，隨著感病程度的增加，中國月季葉片蛋白質含量也發(fā)生變化。感染白粉菌后中國月季葉片內(nèi)蛋白質含量顯著降低，健康葉片（病級為0）蛋白質含量為73．52mg／g，感病程度最大5級葉片蛋白質含量為59．92mg／g，下降了18．50%，差異顯著（P＜0．05）。總體來看，蛋白質含量也隨著感病病級的增加而逐漸下降，呈負相關關系。

2）總糖含量。采用苯酚－硫酸法測定月季葉片內(nèi)總糖含量結果（圖2）表明，感病后總糖含量顯著降低。健康葉片（病級為0）總糖含量為17．84mg／g，感病后至病級為5級（感病程度最大）時，總糖含量為8．94mg／g，下降49．89%，差異達極顯著水平（P＜0．01）。但病級為1時，與健康葉片相比差異不顯著（P＞0．05）?？傮w來看，總糖含量也隨著感病病級的增加而逐漸下降，呈明顯負相關關系。

圖2 不同病級月季葉片的蛋白質含量和總糖含量Fig．2 Protein and carbohydrate content of R．chinensis leaves with different disease level

2．3感病后總糖和蛋白質含量變化

從表看出，感病后蛋白質含量和總糖含量均顯著下降，蛋白質含量下降程度達顯著水平（P＝0．010），而總糖含量下降程度則達極顯著水平（P＜0．001）。同樣，蛋白質與糖類含量的比值（P∶C）也發(fā)生了明顯的變化，感病后P∶C比增大，這是由于感病后蛋白質含量下降程度（18．50%）與總糖含量下降程度（49．89%）相比較小所致。

表 中國月季感染白粉菌后葉片蛋白質和總糖含量Table Leaf protein and total sugar content of R．chinensis inoculated with powdery mildew mg／g

3結論與討論

1）中國月季感染白粉菌后葉片內(nèi)蛋白質和總糖含量與健康葉片相比均顯著下降，并隨著感病程度的增加糖類和蛋白質含量下降程度增加。同時，白粉菌侵染中國月季對葉片內(nèi)2種營養(yǎng)成分的影響還存在時間效應。隨著感病時間的延長，蛋白質含量逐漸下降；而總糖含量變化趨勢則較復雜，呈先增加后明顯下降的規(guī)律。關于植物病原菌侵染對寄主植物營養(yǎng)成分影響的研究較少，但也有研究表明，植物感病后各營養(yǎng)成分發(fā)生了變化。比如，鏈格孢屬（Alternariaspp．）的一種真菌侵染紅豆草（Onobrychis viciaefolia）后，紅豆草莖葉可溶性糖和蛋白質含量明顯升高［8］，該結果與本研究結果相反，表明植物病原菌侵染對寄主植物營養(yǎng)成分的影響因植物種類和病原菌種類不同而異。

2）白粉菌侵染中國月季對中國月季上的甜菜夜蛾有十分明顯的抑制作用，感病后甜菜夜蛾幼蟲取食量明顯下降［1］。但是在病蟲互作關系的研究中，病害對蟲害的影響機理仍不清楚，缺乏寄主植物生理生化變化方面的直接證據(jù)。Simon等［2］的研究表明，柳藍葉甲（Plagiodera versicolora）在被銹?。∕elampsora allii－fragilis）感染的柳樹雜交品種（Salix×cuspidate）葉上的取食量與健康柳葉相比明顯降低，并根據(jù)甲蟲的生物測試結果進行推測，認為銹病對甲蟲造成不利影響重要原因之一是寄主植物水分和營養(yǎng)成分含量變化，但未獲得植物營養(yǎng)成分變化方面的直接證據(jù)。盡管如此，可以推測，包括白粉菌在內(nèi)的植物病原菌對昆蟲造成影響的原因之一是植物體內(nèi)各種營養(yǎng)成分的變化。本研究的結果表明，營養(yǎng)成分含量變化是甜菜夜蛾幼蟲避免取食感染白粉菌的中國月季葉片的重要原因之一。Simon等［2］的研究同時表明，隨著感病時間延長，柳藍葉甲取食量明顯減少，即存在明顯的時間效應。而在本研究中，白粉菌侵染時間越長，最主要的2種營養(yǎng)成分糖類和蛋白質含量下降越明顯，表明白粉菌侵染對營養(yǎng)成分含量的影響也存在明顯的時間效應。因此，進一步說明白粉菌侵染誘導的植物體內(nèi)營養(yǎng)成分變化是甜菜夜蛾受到不利影響的重要原因。

3）感染白粉菌8d后葉片的總糖含量高于健康葉片，原因可能是在白粉菌的誘導下，植物向感病部位運輸可溶性糖的速率加快所致。Simon等［2］也根據(jù)柳藍葉甲的取食行為做出類似的推斷，認為在銹病的誘導下，糖類或其他營養(yǎng)物質會被集中到銹病侵染位置附近供應銹菌生長所需，同時引起柳藍葉甲對該部分葉片的取食量明顯增加。對白粉菌侵染中國月季后是否引起甜菜夜蛾取食量相應地發(fā)生變化尚無專門研究。感菌8d后的蛋白質含量則沒有像總糖那樣升高，可能因為運輸?shù)奶穷愔饕糜诎追劬纳L，而未用于合成植物所需的蛋白質。感病時間大于12d時，無論是總糖還是蛋白質含量均明顯降低，可能與植物體明顯走向衰弱有關。

4）顯而易見，蛋白質和總糖含量的變化對昆蟲的取食會造成明顯的影響。Lee et al［9］利用人工飼料進行的研究結果表明，當人工飼料中蛋白質與糖類的比值（P∶C）為14∶28時，莎草夜蛾（Spodoptera exempta）蛹重達到最大值，而當P∶C值為35∶7時蛹重最小，表明營養(yǎng)成分含量變化明顯影響昆蟲取食，即使營養(yǎng)成分總量不變，P∶C值的變化也會對昆蟲生長發(fā)育帶來明顯影響。除蛋白質和總糖含量變化會影響到昆蟲的生長發(fā)育外，二者比值的變化也可能影響到甜菜夜蛾幼蟲的取食量。但Merkx－Jacques等［10］的研究則表明，甜菜夜蛾幼蟲更偏向取食P∶C值大的人工飼料。本研究結果表明，感染白粉菌后的中國月季葉片中P∶C值顯著增大、差異達顯著水平，但甜菜夜蛾幼蟲的取食量反而顯著減小，與Merkx－Jacques et al［10］的研究結果相反。說明，在蛋白質和總糖含量顯著降低的情況下，P∶C值增大沒能對甜菜夜蛾幼蟲取食帶來促進作用。蛋白質和總糖的總含量變化對甜菜夜蛾幼蟲取食帶來的影響比P∶C值的影響要大得多，是主要影響因素。同樣，Shen et al［11］的研究也表明，紅棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）更愿取食4種健康寄主中粗蛋白含量最高的1種［紅棕（Ravenea rivularis）］。

研究結果初步表明，中國月季感染白粉菌后甜菜夜蛾幼蟲取食感病葉片的數(shù)量減少的原因之一是植物體內(nèi)營養(yǎng)成分含量變化。從植物生理生化變化角度研究病害對蟲害的影響機理，給寄主植物介導的間接的病蟲互作關系的研究奠定了較好的基礎。但是取食量的減少也可能與植物體內(nèi)水分含量變化、各種次生代謝產(chǎn)物種類和含量變化等有關，需要在今后的工作中進一步深入研究。

［1］李 艷，楊發(fā)忠，楊 斌．感染白粉菌玫瑰對甜菜夜蛾幼蟲取食與發(fā)育的影響［J］．西南林學院學報，2010，30（2）：44－46．

［2］Simon M，Hilker M．Does rust infection of willow affect feeding and oviposition behaviour of willow leaf beetles［J］．Journal of Insect Behavior，2005，18：115－129．

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［4］Rost S M，Simon M，Hilker M．Ecological crosseffects of induced plant responses towards herbivores and phytopathogenic fungi［J］．Basic and Applied Ecology，2003，4：43－62．

［5］Cardoza Y J，Alborn H T，TumLinson J H．In vivo Volatile emissions from peanut plants induced by simultaneous fungal infection and insect damage［J］．Journal of Chemical Ecology，2002，28：161－174．

［6］Bradford M M．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilising the principle of protein－dye binding［J］．Analytical Biochemistry，1976，72：248－254．

［7］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al．Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］．Analytical Chemistry，1956，28：350－355．

［8］張俊忠，王 齊，朱建蘭．黑斑病對紅豆草營養(yǎng)成分的影響［J］．甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2008，43（4）：118－120．

［9］Lee K P，Raubenheimer D，Behmer S T，et al．A correlation between macronutrient balancing and insect host－plant range：evidence from the specialist caterpillar Spodoptera exempta（Walker）［J］．Journal of Insect Physiology，2003，49（12）：1161－1171．

［10］Merkx－Jacques M，Despland E，Bede J C．Nutrient utilization by caterpillars of the generalist beet armyworm，Spodoptera exigua［J］．Physiological Entomology，2008，33，51－61．

［11］Shen X P，Ou S S，Xie Y J，et al．Correlation of microstructure of leaf sheath epidermis and nutrient composition of palm plants with the damage degree of red palm fiber elephant［J］．Plant Diseases and Pests，2010，1（2）：58－62．

（責任編輯：聶克艷）

Change in Protein and Carbohydrate Content of Rosa chinensis Infected with Powdery Mildew

YANG Fazhong1，YANG Deqiang Yang2，YANG Bin1＊
（1．Yunnan Key Laboratory for Warning and Control of Forest Disaster，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224；2．School of Information，Yunnan Normal University，Kunming，Yunnan 650224，China）

The carbohydrate and protein content in R．chinensis plants infected with powder mildew was determined by photometry analysis to lay the foundation for the interaction mechanism between diseases and pests indirectly mediated by host plants．Results：The protein content of R．chinensis plants infected with Sphaerotheca pannosa declines gradually but its total sugar content shows a first rising and then declining trend with prolongation of diseased time．Sphaerotheca pannosa infection has the obvious time effect on leaf protein and total sugar content of R．chinensis．The protein and total sugar content in leaves of R．chinensis deceases with increase of diseased degree significantly，and the protein and total sugar content decreases from 73．52mg／g to 59．92mg／g and from 17．84mg／g to 8．94mg／g respectively．

Rosa chinensis；powdery mildew；total sugar；protein；interaction between diseases and pests；time effect植物病原菌侵染寄主植物對植物體內(nèi)營養(yǎng)成分變化的相關研究較少，白粉菌侵染中國月季能否誘導植物體內(nèi)糖類和蛋白質含量變化國內(nèi)外還未見文獻報道。已有研究表明，白粉菌侵染中國月季對甜菜夜蛾取食產(chǎn)生了明顯的抑制作用［1］，但造成這種抑制作用的原因還不清楚。同樣，已有較多的研究表明，在植物病原菌－寄主植物－昆蟲組成的三元系統(tǒng)中，存在著寄主植物介導的間接病蟲相互作用［24］。植物病原菌侵染寄主植物可能對共享寄主的昆蟲造成不利影響，但也可能造成有利影響［5］，或是沒有影響，結果與植物種類、昆蟲種類和病原菌種類有關。目前，對其影響機理的研究還未見文獻報道。然而，研究寄主植物介導的間接病蟲互作關系的植物保護學家根據(jù)所得相關結果進行推測，病害對蟲害的影響與植物病原菌誘導的植物生理生化代謝的變化有著直接的關系［2，4］。病原菌侵染可能誘導植物水分含量變化、營養(yǎng)成分含量變化以及各種次生代謝產(chǎn)物含量變化等［2］，從而對昆蟲產(chǎn)生有利或不利的影響。因此，中國月季感染白粉菌后植物體內(nèi)糖類和蛋白質含量變化可能是甜菜夜蛾取食受到抑制的重要原因之一。為了對白粉菌侵染中國月季對甜菜夜蛾的影響機理提供依據(jù)，采用光度分析法研究白粉菌侵染中國月季植株對植物體內(nèi)糖類和蛋白質含量的影響，研究感病對植物營養(yǎng)成分影響的時間效應，亦為寄主植物介導的間接病蟲互作機理研究奠定基礎。

S432．4＋4

A

1001－3601（2016）02－0070－0081－04

2015－05－02；2016－02－08修回

國家自然科學基金項目“白粉菌侵染玫瑰對甜菜夜蛾的影響及機理研究”（31160354）

楊發(fā)忠（1974－），男，副教授，碩士，從事植物保護方面的研究。E－mail：yangfazhong105＠163．com

＊通訊作者：楊 斌（1971－），男，教授，博士，從事森林保護方面的研究。E－mail：yangbin48053＠163．com