琥珀酸的生物制造：細菌還是酵母？

李嬌嬌 祁慶生（山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100）

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琥珀酸的生物制造：細菌還是酵母？

李嬌嬌 祁慶生
（山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100）

祁慶生，教授，德國明斯特大學微生物學博士，2001年被聘為德國開姆尼茨工業(yè)大學生物工程系課題組負責人。2004年回國任山東大學微生物技術(shù)國家重點實驗室教授，博士生導(dǎo)師；國家糖工程技術(shù)研究中心研究員，山東大學微生物研究所所長。2006年獲教育部“新世紀優(yōu)秀人才”。主持國家自然科學基金、教育部重點項目、國家863項目、973子課題等多項。主要從事工業(yè)微生物的代謝途徑設(shè)計、代謝工程改造以及合成生物學等方面的研究。在國際國內(nèi)著名學術(shù)期刊上發(fā)表論文100余篇，申請和獲得國家發(fā)明專利20余項。

E-mail:qiqingsheng@sdu.edu.cn

琥珀酸又稱丁二酸，是一種重要的有機合成中間體。許多微生物都可以通過優(yōu)化和代謝工程改造產(chǎn)生琥珀酸。文章對細菌和酵母兩種主要的產(chǎn)琥珀酸類群產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率及后提取等因素進行了詳細的分析，并比較了兩種微生物生產(chǎn)琥珀酸 各自的優(yōu)缺點，為今后開發(fā)利用琥珀酸的生物制造提供參考。

1 琥珀酸簡介

琥珀酸又稱丁二酸，是一種安全的天然有機酸，并且被美國能源部認為是未來12種最具價值的生物煉制產(chǎn)品之一。琥珀酸可以廣泛地應(yīng)用于清潔劑、表面活性劑、食品添加劑、抗菌劑以及制藥行業(yè)，并用以合成多種重要化學品，如γ-丁內(nèi)酯、1，4-丁二醇、四氫呋喃和2-吡咯烷酮等①②。同時，作為一種重要的有機合成中間體，琥珀酸還是合成多種聚酯（例如可降解聚酯PBS）的重要前體物質(zhì)③。琥珀酸近年來逐漸攀升為大宗化學品，全球琥珀酸的年產(chǎn)量在3萬～5萬噸④。根據(jù)MarketsandMarkets的調(diào)查報告，琥珀酸的市場需求在2011～2016年間會以18.7%的速率穩(wěn)定增長。

傳統(tǒng)上琥珀酸是化學合成的。該過程需要金屬Pd和Ru的催化，通過丁烷制備順式丁烯二酸酐再經(jīng)化學方法加工而成⑤。但由于石油資源的減少和環(huán)境污染問題，人們開始尋求一種資源可再生的、高效環(huán)保的琥珀酸生產(chǎn)方式。而琥珀酸是微生物細胞中心代謝三羧酸循環(huán)（TCA）的中間代謝產(chǎn)物之一，并且還是多種兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌的代謝末端產(chǎn)物，可以通過微生物利用可再生的碳水化合物資源進行生產(chǎn)。

2 產(chǎn)琥珀酸的細菌

許多天然生產(chǎn)琥珀酸的菌株是從瘤胃中分離出來的，如產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌、脆弱桿菌。這些菌株都是兼性厭氧或者嚴格厭氧的革蘭陰性菌，嗜溫、嗜CO2，并且對高濃度的琥珀酸有著良好的抗?jié)B透壓性能⑥⑦。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠利用多種碳源發(fā)酵，并且對葡萄糖和琥珀酸的耐受性可以高達158g/L和104g/L⑧。Guettler等⑨以葡萄糖為碳源用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量可達106g/L，產(chǎn)率接近0.9g/g。對產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌的研究大多數(shù)集中在利用多種碳源為原料及菌株優(yōu)化方法上⑩。Meynial-Salles等?用產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌進行連續(xù)的厭氧發(fā)酵得到83g/L的琥珀酸，琥珀酸的生產(chǎn)力達到10.4g/（L·h）。另外一種瘤胃細菌曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌也可以利用多種碳源生產(chǎn)琥珀酸。與產(chǎn)琥珀酸放線桿菌不同的是，曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌能夠有氧生長，有完整的TCA循環(huán)。曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌的琥珀酸生產(chǎn)能力弱于上述兩種天然宿主菌，文獻中報道的其琥珀酸產(chǎn)量大多在十幾克??。而據(jù)報道，BASF/Purac JV公司分離得到的一種脆弱桿菌，可以高效生產(chǎn)琥珀酸。

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因為在自然界中這些微生物存在于氨基酸和維生素豐富的地方，天然生產(chǎn)琥珀酸的瘤胃菌株有許多營養(yǎng)缺陷型菌株，所以這些菌株的生長需要昂貴、營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，導(dǎo)致琥珀酸的生產(chǎn)成本增加⑦。為了解決這些問題，人們開始采用遺傳背景研究清楚的、非天然生產(chǎn)琥珀酸的工業(yè)生產(chǎn)菌株例如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌，經(jīng)過代謝工程改造生產(chǎn)琥珀酸。

谷氨酸棒桿菌是一種生長良好、安全易于控制的生產(chǎn)宿主，多用于氨基酸的大規(guī)模生產(chǎn)?。谷氨酸棒桿菌可以通過雙階段發(fā)酵，在厭氧時還原的TCA途徑產(chǎn)生琥珀酸。通過細胞循環(huán)的分批補料發(fā)酵方式，琥珀酸的產(chǎn)量高達146g/L，產(chǎn)率達到1.4mol/mol?。Litsanov等?以葡萄糖、甲酸和碳酸氫鹽為底物發(fā)酵得到134g/L琥珀酸，產(chǎn)率達到1.67mol/mol。由此可見，利用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)琥珀酸具有一定優(yōu)勢，但是由于生產(chǎn)過程需要有氧-厭氧雙階段，會導(dǎo)致全階段琥珀酸產(chǎn)率較低，并且有氧階段會大大增加琥珀酸的生產(chǎn)成本。

大腸桿菌是一種兼性厭氧菌。厭氧條件下，野生型大腸桿菌進行混合酸發(fā)酵，產(chǎn)物包括甲酸、乳酸、乙酸、乙醇，以及少量的琥珀酸?。有氧條件下生產(chǎn)琥珀酸需要失活琥珀酸脫氫酶（SDH），阻斷TCA循環(huán)中間體琥珀酸向下游轉(zhuǎn)化，也可以通過打開乙醛酸支路來積累琥珀酸。在有氧條件下，以葡萄糖為碳源生產(chǎn)琥珀酸得率為1mol/mol?。而厭氧條件下的琥珀酸發(fā)酵是通過還原的TCA支路和部分乙醛酸支路進行，其中還原支路需要固定一分子CO2，因此厭氧發(fā)酵有助于減少溫室氣體的量，是一種環(huán)境友好型生物過程，其理論產(chǎn)率為1.714mol/mol，在額外補充足夠還原力的情況下理論產(chǎn)率更可以達到2mol/mol?。鑒于此，厭氧是高效產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵方式。筆者實驗室構(gòu)建的工程菌YL106/pSCsfcA以葡萄糖為底物進行全階段發(fā)酵，琥珀酸生產(chǎn)力達2.13g/（L·h），琥珀酸產(chǎn)量達到85.3g/L，產(chǎn)率超過0.88g/g?。天津工業(yè)生物技術(shù)所張學禮等?通過代謝進化技術(shù)構(gòu)建高效生產(chǎn)琥珀酸的菌株HX024，厭氧發(fā)酵琥珀酸的產(chǎn)量達到96g/L。然后又利用反向代謝工程技術(shù)，在出發(fā)菌株中激活磷酸戊糖途徑、轉(zhuǎn)氫酶和丙酮酸脫氫酶，提高菌株還原力NADH的供應(yīng)，厭氧發(fā)酵琥珀酸的產(chǎn)率提高到1.5mol/mol（理論產(chǎn)率的88%）?。此前該課題組與山東蘭典生物科技股份有限公司合作完成了琥珀酸10m3發(fā)酵罐中試，琥珀酸產(chǎn)率達1.0g/g，提取收率達82%，純度達99.5%以上。Myriant公司也用工程化的大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸，據(jù)稱2013年產(chǎn)量達到13 600噸。Myriant還與中國藍星集團合資生產(chǎn)琥珀酸。

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3 產(chǎn)琥珀酸的酵母

細菌的培養(yǎng)和發(fā)酵需要一個接近中性的環(huán)境，所以大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過程中需要不斷添加堿來維持pH穩(wěn)定。這會增加發(fā)酵過程中染菌的概率，使琥珀酸的下游工業(yè)處理（DSP）過程更加復(fù)雜，造成琥珀酸分離成本增加⑦?。而酵母生長良好，性能優(yōu)良穩(wěn)定，且可以在弱酸性條件下生長，對各種工業(yè)條件下的壓力都有顯著的抵抗性，如耐酸性、抗?jié)B透性和耐高底物水平。

釀酒酵母的底物來源廣泛，培養(yǎng)條件可以有氧也可以厭氧。在酵母中生產(chǎn)琥珀酸最初是為了改善釀酒酵母所產(chǎn)的酒的風味，研究主要集中在TCA循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶、延胡索酸酶（FUM）等，最終產(chǎn)量小于0.7g/L?。有氧條件下，釀酒酵母的還原TCA還原支路在熱力學上不易發(fā)生，并且催化草酰乙酸生產(chǎn)琥珀酸的酶受到葡萄糖的抑制?。因此許多研究都集中在釀酒酵母在厭氧條件下生產(chǎn)琥珀酸。通過敲除琥珀酸脫氫酶和延胡索酸酶來阻斷線粒體TCA循環(huán)積累琥珀酸??。也可以通過敲除琥珀酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶（IDP1）利用氧化的TCA循環(huán)和乙醛酸途徑共同積累琥珀酸?。與大腸桿菌類似，酵母的厭氧理論產(chǎn)率高于有氧理論產(chǎn)率。Yan等?敲除釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶（PDC）、延胡索酸酶基因，并且優(yōu)化胞質(zhì)內(nèi)還原TCA支路各步驟的酶，得到12.97g/L琥珀酸，產(chǎn)率為0.21mol/mol葡萄糖，發(fā)酵pH維持在3.8。Verwaal等?也通過相似的方法，利用釀酒酵母還原的TCA途徑生產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量達到43g/L。工業(yè)生產(chǎn)中，DSM/Roquette合資公司以釀酒酵母為生產(chǎn)菌株，但沒有獲得其最終生產(chǎn)指標。

解脂耶氏酵母是被廣泛研究的一類非慣用酵母，嚴格好氧，需利用完整的TCA循環(huán)來維持生長?。解脂耶氏酵母可以利用的底物很廣泛，如葡萄糖、乙醇、脂肪酸、油脂和正構(gòu)烷烴等，因為它能積累大量的有機酸，尤其是TCA循環(huán)的中間體檸檬酸、異檸檬酸和α-酮戊二酸等，是一種重要的工業(yè)菌株。一些學者通過突變琥珀酸脫氫酶，篩選酶活力降低的突變株來積累琥珀酸?。Kamzolova?以構(gòu)建好的α-酮戊二酸解脂酵母為生產(chǎn)菌株，以乙醇為底物在過氧化氫存在的情況下脫羧生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸的產(chǎn)量為71.7g/L，并且發(fā)酵液中琥珀酸的回收率達到72%。Yuzbashev等?利用突變了琥珀酸脫氫酶的解脂酵母，以甘油為底物、碳酸鈣為緩沖劑進行低pH琥珀酸發(fā)酵，得到45g/L的琥珀酸。筆者實驗室構(gòu)建的琥珀酸脫氫酶突變的解脂酵母以甘油為底物，通過長時間發(fā)酵最后得到160g/L琥珀酸，說明其對琥珀酸具有較高的耐受力（文章在投）。

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4 細菌與酵母琥珀酸生物制造過程比較

表1　琥珀酸生產(chǎn)菌株發(fā)酵能力比較

目前，在琥珀酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)力方面，細菌都具有一定的優(yōu)勢，而報道的酵母生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)力都不高（表1）。釀酒酵母具有較好的耐受能力，特別是對pH的耐受性較高，而細菌對酸和滲透壓力耐受性低，發(fā)酵過程中需要調(diào)節(jié)pH，這會增加生產(chǎn)成本，也使發(fā)酵過程更易染菌。然而，酵母維持細胞外大量的琥珀酸以游離狀態(tài)存在，將需要消耗胞內(nèi)的能量來維持胞內(nèi)pH和阻止酸順濃度梯度的跨膜運輸。這種額外消耗能量對酵母的厭氧生產(chǎn)過程不利，因為酵母厭氧過程產(chǎn)生的ATP很少，主要依賴底物水平磷酸化而非有氧時的氧化磷酸化。作為弱酸，琥珀酸在低pH的培養(yǎng)基中會轉(zhuǎn)換為不溶的形式，與帶電分子的形式相比，不溶的琥珀酸可以通過被動擴散穿過胞質(zhì)膜進入細胞。為了解決這一問題，研究者提出微好氧發(fā)酵這一策略，使一部分底物通過氧化磷酸化，產(chǎn)生的ATP可以補充厭氧支路ATP缺少的情況?。

表2　細菌與酵母琥珀酸制造過程比較

影響琥珀酸生產(chǎn)成本的最主要階段是琥珀酸提取純化階段（表2）。細菌發(fā)酵中得到的琥珀酸鹽需要轉(zhuǎn)化為游離琥珀酸，該階段的成本大概占到產(chǎn)物成本的60%～70%?。酵母可以進行低pH的生物發(fā)酵，除去菌體后的發(fā)酵液可以直接蒸發(fā)結(jié)晶，而需要中性環(huán)境的細菌生產(chǎn)琥珀酸過程，要先進行電滲析或者酸化超濾過程再蒸發(fā)結(jié)晶，其中電滲析過程需要大量能量，酸化過程還會有副產(chǎn)物硫酸銨的產(chǎn)生?。酵母低pH（小于3）的生物發(fā)酵直接把底物轉(zhuǎn)化為琥珀酸，這使產(chǎn)物的下游處理步驟少于細菌發(fā)酵。綜上所述，就目前琥珀酸的產(chǎn)量、產(chǎn)率與生產(chǎn)力而言，工程化的大腸桿菌似乎更具有優(yōu)勢。但是，從長遠來看，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，如果解決了酵母生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率和生產(chǎn)力較低的問題，也許酵母比大腸桿菌更適于琥珀酸的生物制造。

[致謝：本項目得到了國家自然科學基金(31170097)，山東省科技發(fā)展計劃(2015GSF121042)及微生物技術(shù)國家重點實驗室(M2014-03)的資金支持。]

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作者簡介

doi:10.3969/j.issn.1674-0319.2016.01.004