蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響

李寧，李磊，趙登攀，李曉濤，張曉峰*

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上?！?00071；2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上?！?00241)

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響

李寧1，李磊2，趙登攀2，李曉濤2，張曉峰1*

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，上海200071；2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海200241)

【摘要】目的研究蛋白酶體REGγ對雄性小鼠生精功能的影響。方法利用免疫蛋白印跡檢測小鼠睪丸中REGγ的表達(dá)；通過組合酶消化法分離精原干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測精原干細(xì)胞中c-kit及α6-integrin的表達(dá)；通過小鼠精子分析儀檢測REGγ基因敲除雄鼠的精子濃度和精子活力；進(jìn)行小鼠合籠實(shí)驗(yàn)檢測正常雌鼠和REGγ基因敲除雄鼠合籠后的生育力。結(jié)果REGγ在小鼠睪丸中高表達(dá)；應(yīng)用組合酶消化法得到了純度70%的精原干細(xì)胞；REGγ基因敲除雄鼠精原干細(xì)胞的c-kit及α6-integrin表達(dá)量均顯著低于野生型組(P<0.05)；REGγ基因敲除型雄鼠的平均精子濃度(37.1×106/ml)和精子活力(54%)均顯著低于野生型雄鼠(75.4×106/ml、74%)(P<0.05)；REGγ基因敲除型雄鼠與野生型雌鼠合籠后的產(chǎn)仔數(shù)均低于野生型雄鼠(P<0.05)。結(jié)論蛋白酶體REGγ參與調(diào)節(jié)雄鼠的生精功能。

【關(guān)鍵詞】REGγ；生精；精原干細(xì)胞

(JReprodMed2016，25(3)：242-247)

11S蛋白酶體激活因子γ(REGγ)系蛋白酶體激活因子REG家族成員蛋白，通過非泛素和ATP依賴途徑催化蛋白酶體20S的蛋白水解活性[1-2]。過去認(rèn)為，REGγ只能促進(jìn)蛋白酶體降解一些細(xì)胞內(nèi)的短肽，但是不能降解細(xì)胞內(nèi)完整的蛋白分子[3]，此觀念一度影響了科學(xué)家對REGγ的重視程度。2006年，Li等[3]首次發(fā)現(xiàn)了REGγ-20S蛋白酶體的第一個(gè)細(xì)胞內(nèi)完整的蛋白分子底物SRC-3，隨后，又相繼發(fā)現(xiàn)了另外一些細(xì)胞內(nèi)完整的蛋白分子底物，如細(xì)胞周期抑制蛋白p21、p16和p14等[4-5]，促進(jìn)了對REGγ功能的認(rèn)識(shí)。越來越多的證據(jù)顯示REGγ可能在許多生理以及病理過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。REGγ通過不同機(jī)制調(diào)控p53的穩(wěn)定性及活性，進(jìn)而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能[6-7]；在有絲分裂過程中，REGγ可以維持染色體穩(wěn)定的功能，REGγ在核斑點(diǎn)的形成過程中發(fā)揮重要的功能[8]。近期發(fā)現(xiàn)，REGγ通過降解B細(xì)胞活化誘導(dǎo)激活胞嘧啶核苷脫氨酶影響B(tài)細(xì)胞抗體多樣化的產(chǎn)生[8]；一些研究也表明，REGγ與許多癌癥的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)[9-11]。本文研究了REGγ對雄性小鼠生殖功能的影響。

材料與方法

一、試劑和儀器

主要試劑：膠原酶VI、透明脂酸酶、胰酶(Sigma，美國，20140913、20140822、20140911)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清(NBS)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國，批號(hào)140820)；羊抗鼠REGγ單克隆抗體抗體、羊抗鼠PLZF單克隆抗體(Santa Cruz，美國，批號(hào)20140911、20141119)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天)。

儀器：CytoFLEX流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER，美國)；Odessey雙色激光掃描成像系統(tǒng)(Li-Cor Bioscience，美國)；FlexStation3酶標(biāo)分析儀(MolecularDevices，美國)；Tanon-6600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技)；GNP型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)；HTM-IVOS精子活力測定儀(徐州信達(dá)醫(yī)療)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：野生型及REGγ基因敲除型C57BL6小黑鼠購自John Monaco教授實(shí)驗(yàn)室，在華東師范大學(xué)SPF級動(dòng)物房飼養(yǎng)[12]。合籠實(shí)驗(yàn)按照以下方式進(jìn)行：首先用REGγ雜合子雄鼠和REGγ雜合子雌鼠進(jìn)行合籠，得到同窩的野生型雄鼠和REGγ基因敲除型雄鼠，然后用得到的同窩型野生型雄鼠(野生型組)及REGγ基因敲除雄鼠(基因敲除型組)分別和野生型雌鼠合籠。

2. 精原干細(xì)胞的分離與純化：參照Pramod的方法[13]，取7～8 d齡雄性小鼠12～15只，頸椎脫臼法處死。無菌收集兩側(cè)睪丸，置于盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的小皿中。整個(gè)睪丸收集過程在30 min內(nèi)完成。用尖鑷子仔細(xì)去除每個(gè)睪丸的脂肪墊、附睪及睪丸白膜，加入適量PBS(2～3 ml)，吸管用力吹打，將曲細(xì)精管吹散。加入相當(dāng)于組織體積10倍的含1 g/L膠原酶的PBS后入溫箱，在37 ℃、5% CO2條件下作用15 min (期間晃動(dòng)數(shù)次)。之后移入5 ml的離心管，輕緩吹打1～2次，靜置待曲細(xì)精管段沉降后輕輕吸除上清，再重復(fù)上述過程1次。加入含1.5 g/L透明質(zhì)酸酶和0.25%胰蛋白酶的PBS后入溫箱，同樣條件下作用5～10 min，倒置顯微鏡下見曲細(xì)精管段軟散，有的已消散成單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)即可。加入含10% NBS、1%青、鏈霉素的新鮮DMEM培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中，1 000 r/min離心3 min或靜置5 min，待軟散的曲細(xì)精管及已解離的精原干細(xì)胞沉降后，輕輕吸去上清。重新加入1.5 ml新鮮培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1% 青、鏈霉素)，吹打8～10次，吹打數(shù)次制成單細(xì)胞懸液。在7～8 d齡小鼠的睪丸曲細(xì)精管上皮上，只存在2種類型的細(xì)胞，即A型精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞。將制備的單細(xì)胞懸液接種置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)支持細(xì)胞與精原干細(xì)胞貼壁速度快慢的差異，利用選擇性貼壁法，待支持細(xì)胞開始貼壁極化而精原干細(xì)胞仍然懸浮時(shí)(體外培養(yǎng)約6～7 h)，將未貼壁的精原干細(xì)胞隨培養(yǎng)基離心收集，準(zhǔn)備進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

3. 堿性磷酸酶染色鑒定精原干細(xì)胞：按照試劑盒進(jìn)行操作。

4. 流式細(xì)胞儀測定c-kit與α6-interin：將收集到的精原干細(xì)胞分別添加c-kit與α6-interin抗體，37 ℃孵育1 h，加入到流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。

5. 小鼠精子濃度及活力鑒定：取8～10周性成熟雄鼠，剖腹取出兩側(cè)附睪，剪刀剪開附睪并置于事先準(zhǔn)備好的凹形玻璃皿內(nèi)，37 ℃放置5 min，使精子充分釋放出來。5 min后，去除組織碎片，用細(xì)的玻璃虹吸管依靠虹吸作用吸取含精子的培養(yǎng)液，置于HTM-IVOS精子活力測定儀中測定。精子濃度過高時(shí)需要用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行測定。

6. 免疫蛋白印跡(Western blotting)小鼠睪丸中REGγ蛋白的表達(dá)：提取大腦、唾腺、肺、胃、結(jié)腸、腎、睪丸、附睪及胸腺組織。用脫頸椎法處死野生型成年小鼠后，迅速采集上述組織置于研缽中并加入液氮低溫研磨，用組織裂解液進(jìn)行裂解，進(jìn)行免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

7. 免疫組織熒光檢測：取1周齡雄鼠睪丸，4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm切片。按組織免疫熒光常規(guī)步驟操作。一抗1∶1 000稀釋。免疫熒光顯微鏡掃描成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、精原干細(xì)胞的分離及鑒定

1. 采用組合酶消化、選擇性貼壁的方法，分離得到的精原干細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，精原干細(xì)胞的純度可以達(dá)到75%以上(表1)。

表1　組合酶消化法分離純化精原干細(xì)胞的結(jié)果

2.堿性磷酸酶染色結(jié)果：堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，精原干細(xì)胞有褐色附著物(圖1A)。

3. 流式細(xì)胞儀及精子濃度、活力分析結(jié)果：在6～8 d的小鼠睪丸中存在兩種細(xì)胞，分別是精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞。通過分離精原干細(xì)胞并檢測其特定基因的表達(dá)，分析REGγ基因?qū)π∈缶杉?xì)胞的影響，從而得到其對雄性生殖的影響。流式細(xì)胞儀分析表明，野生型小鼠精原干細(xì)胞α6-integrin 與c-kit基因的表達(dá)均高于REGγ 基因敲除小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1 B)。對10對野生型雄鼠和REGγ基因敲除型雄鼠測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：野生型雄鼠平均精子濃度為75.4×106/ml，精子活力為74%；而REGγ基因敲除型雄鼠平均精子濃度為37.1×106/ml，精子活力為54%。從結(jié)果可以看出，敲除REGγ導(dǎo)致了雄性小鼠精子濃度和精子活力的降低，與野生型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

與野生型組比較，*P<0.051A：堿性磷酸酶鑒定結(jié)果×100　1B：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖1　精原干細(xì)胞的分離鑒定

與野生型組比較，*P<0.052A：REGγ基因敲除雄鼠與野生型雄鼠精子濃度　2B：REGγ基因敲除雄鼠與野生型雄鼠精子活力圖2　REGγ基因敲除雄鼠精子濃度和精子活力

二、REGγ在睪丸組織中高表達(dá)

相對于其他組織，REGγ在睪丸中表達(dá)量很高，提示REGγ可能在雄性生殖方面發(fā)揮了一定的生物學(xué)功能(圖3)。REGγ與PLZF蛋白表達(dá)位置一致，由于PLZF是精原干細(xì)胞標(biāo)志分子，通過對1周齡野生型雄鼠睪丸組織檢測表明，REGγ與PLZF在精原干細(xì)胞中共表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)(圖4)。

圖3　Western blotting檢測REGγ在成年小鼠各個(gè)組織表達(dá)分布

圖4　REGγ和PLZF在精原干細(xì)胞中共表達(dá) 免疫熒光染色法 ×20

五、REGγ基因敲除雄鼠后代減少

REGγ基因敲除雄鼠在繁殖后代的能力方面顯著低于野生型雄鼠 (P<0.05)。野生型雌鼠在與REGγ基因敲除雄鼠合籠時(shí)，其產(chǎn)生后代的周期變長，且每窩產(chǎn)生的小鼠后代數(shù)目有顯著的減少(表2)。

表2　野生型組(REGγ+/+)和基因敲除型組(REGγ-/-)

注：與野生型組比較，*P<0.05

討論

真核生物細(xì)胞中存在不同種類的能夠激活20S的激活因子，如19S，11S等，形成各種結(jié)構(gòu)不盡相同的20S蛋白酶體與調(diào)節(jié)亞基的復(fù)合物[14]。其中兩種蛋白酶體激活因子PA200與REGγ有很高的相似度。PA200在DNA損傷修復(fù)中有很重要的作用[15]，而REGγ能夠通過影響p21、p53的水平作用于細(xì)胞周期[6]，提示PA200與REGγ作用的相似性。有研究表明[16]，PA200參與小鼠精子發(fā)生的過程，而與PA200有極高相似性的REGγ在雄鼠睪丸組織中有很高的表達(dá)，因此，有必要對REGγ在小鼠生精過程中的作用進(jìn)行深入的探討。

為了獲得高純度的小鼠精原干細(xì)胞用于REGγ功能的研究，根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[13]，本實(shí)驗(yàn)利用改進(jìn)的組合酶消化法將生精小管制成細(xì)胞懸液，組合酶包括膠原酶IV、胰蛋白酶和透明質(zhì)酸酶。膠原酶IV和透明質(zhì)酸酶主要消化細(xì)胞間質(zhì)，對細(xì)胞影響不大。胰蛋白酶的短時(shí)、多次消化可以減少對細(xì)胞的損傷，并能充分分離精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這種組合酶消化法可以制備出高含量和高質(zhì)量的精原干細(xì)胞懸液。然后利用兩次選擇性貼壁法收集精原干細(xì)胞，所得細(xì)胞70%以上均為精原干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，此方法分離得到的細(xì)胞數(shù)量多，純度比較高，增生旺盛，而且分離時(shí)間短，污染機(jī)會(huì)少，工作效率顯著提高。

在小鼠及大鼠的睪丸中，kit配體是由支持細(xì)胞分泌的，而c-kit受體則存在于A型精原干細(xì)胞上。在B型及初級精母細(xì)胞為低水平表達(dá)，在精子細(xì)胞中不表達(dá)，因此，c-kit受體可作為A型精原干細(xì)胞的標(biāo)志物，但該受體并不是精原干細(xì)胞特有的標(biāo)志物，在其它干細(xì)胞中也有表達(dá)，故也常作為干細(xì)胞的一個(gè)常見的輔助檢測指標(biāo)[17]，結(jié)合精原干細(xì)胞膜表達(dá)蛋白α6-整合蛋白[18]，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)，表明在REGγ基因敲除雄鼠睪丸內(nèi)，精原干細(xì)胞數(shù)目明顯減少，而精原干細(xì)胞是精子發(fā)生的起點(diǎn)，精原干細(xì)胞數(shù)目的減少對精子發(fā)生過程產(chǎn)生影響并導(dǎo)致精子濃度的降低，最終表現(xiàn)為REGγ基因敲除雄鼠生殖能力的下降。

REGγ在睪丸組織內(nèi)高表達(dá)，表明REGγ有可能在睪丸中發(fā)揮著某種生物學(xué)功能。本文通過對野生型及REGγ基因敲除雄鼠進(jìn)行系統(tǒng)的研究分析，發(fā)現(xiàn)敲除REGγ基因使得雄性小鼠生殖能力降低，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)與REGγ基因敲除雄鼠合籠的野生型雌鼠產(chǎn)生的后代數(shù)目減少；(2)REGγ基因敲除雄鼠精子濃度降低；(3)REGγ基因敲除雄鼠精子活力降低。這幾個(gè)指標(biāo)的高低都代表著雄性生殖能力的強(qiáng)弱。相比較于野生型雄鼠，ERGγ基因敲除雄鼠這幾個(gè)指標(biāo)數(shù)值的降低，表明REGγ基因敲除雄鼠的生殖能力降低。

通過對野生型及REGγ基因敲除雄鼠睪丸組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)REGγ敲除雄鼠睪丸內(nèi)精原干細(xì)胞的數(shù)目較野生型雄鼠有一定程度減少。REGγ基因敲除雄鼠睪丸內(nèi)PLZF陽性細(xì)胞較野生型雄鼠有明顯減少，表明REGγ基因敲除雄鼠睪丸內(nèi)PLZF蛋白含量的減少導(dǎo)致了精原干細(xì)胞數(shù)目的減少。

PLZF是未分化的精原干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，而且對于維持精原干細(xì)胞的自我更新發(fā)揮著重要的作用[19]。REGγ蛋白酶體的激活可以刺激P53蛋白的降解，P53/TGF-β信號(hào)通路可以通過REGγ的過表達(dá)干擾REGγ-20S蛋白酶體的信號(hào)通路。通過降解P53蛋白介導(dǎo)的對精原干細(xì)胞重要因子PLZF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致REGγ基因敲除雄鼠睪丸內(nèi)PLZF蛋白的低表達(dá)，并最終導(dǎo)致精原干細(xì)胞數(shù)目減少[2]。但是REGγ是如何通過P53介導(dǎo)，其具體的信號(hào)通路是否只是通過PLZF轉(zhuǎn)錄調(diào)控，或者有其它的通路還需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，REGγ敲除小鼠精子濃度、活力以及后代數(shù)目明顯低于野生型小鼠，初步驗(yàn)證了其在小鼠生精過程中的重要功能，揭示了REGγ在雄性生殖系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用，為REGγ在男性不孕不育病癥的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Nikaido T，Shimada K，Shibata M，et al. Cloning and nucleotide sequence of cDNA for Ki antigen，a highly conserved nuclear protein detected with sera from patients with systemic lupus erythematosus[J]. Clin Exp.Immunol，1990，79：209-214.

[2]Ali A，Wang Z，F(xiàn)U J，et al. Differential regulation of the REGγ-proteasome pathway by p53/TGF-β signaling and mutant p53 in cancer cells[J]. Nat Commun，2013，4：2667.

[3]Li X，Lonard DM，Junq SY，et al. The SRC-3/AIB1 coactivator is degraded in ubiquitin-and ATP-independent manner by the REGγ proteasome[J]. Cell，2006，124：381-392.

[4]Chen X，Barton LF，Chi Y，et al. Ubiqutin-independent degradation of cell-cycle inhibitors by the REGγ proteasome[J]. Mol Cell，2007，26：843-852.

[5]Wu Y，Wang L，Zhou P，et al. Regulation of REGγ cellular distribution and function by SUMO sodification[J]. Cell Res，2011，21：807-816.

[6]Liu J，Yu G，Zhao Y，et al. REGγ modulates p53 activity by regulating its cellular localization[J]. J Cell Sci，2010，123：4076-4084.

[7]Levy-Barda A，Lerenthal Y，Davis AJ，et al. Involvment of the muclear proteasome activator PA28γ in the cellular response to DNA duble-strand breaks[J]. Cell Cycle，2011，10：4300-4310.

[8]Masson P，Lundin D，Soderbom F，et al. Characterization of a REG/PA28 proteasome activator homolog in dictyostelium discoideum indicates that the ubiquitin-and ATP-independent REGgamma proteasome is an ancient nuclear protease[J]. Eukaryot Cell，2009，8：844-851.

[9]He J，Cui L，Zeng Y，et al. REGγ is assoiciated with multiple oncogenic pathways in human cancers[J]. BMC cancer，2012，12：75.

[10]Roessler M，Rollinger W，Mantovani-Endi L，et al. Indentification of PSME3 as novel serum tumor marker for colorectal cancer by combining two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with a strictly mass spectrometry-based approach for data analysis[J]. Mol Cell Proteomics，2006，5：2092-2101.

[11]Zhang M，Gan L，Ren GS，et al. REGγ is a strong candidate for the regulation of cell cycle，proliferation and the invasion by pooly differentiated thyroid carcinoma cells[J]. Braz J Med Biol Res，2012，45：459-465.

[12]Li L，Dang Y，Zhang J，et al. REGγ is critical for skin carcinogenesis by modulating the Wnt/β-catenin pathway[J]. Nat Commun，2015，6：6875.

[13]Pramod RK，Mitra A. In vitro culture and characterization of spermatogonial stem cells on sertoli cell feeder layer in goat(Capra hircus)[J]. J Assist Reprod Genet，2014，31：993-1001.

[14]Demartino GN，Gillette TG. Progeasomes：machines for all reasons[J]. Cell，2007，129：659-662.

[15]Ustrell V，Hoffman L，Pratt G，et al. PA200，a nuclear proteasome activator involved in DNA repair[J]. EMBO J，2002，21：3516-3525.

[16]Khor B，Bredemeyer AL，Huang CY，et al. Proteasome activator PA200 is required for nomal spermatogenesis[J]. Mol Cell Biol，2006，26：2999-3007.

[17]Chan F，Oatley MJ，Kaucher AV，et al. Functional and molecular features of the Id4+germline stem cell population in mouse testes[J]. Genes Dev，2014，28：1351-1362.

[18]Shinohara T，Avarbock MR. Brinster RL，et al. β1-and α6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells[J]. Proc Natl Acad，1999，96：5504-5509.

[19]Filipponi D，Hobbs RM，Ottolenqhi S，et al. Repression of kit expression by Plzf in germ cells[J]. Mol Cell Biol，2007，27：6770-6781.

[編輯：侯麗]

Effects of REGγ on spermatogenesis of male mouse

LINing1，LILei2，ZHAODeng-pan2，LIXiao-tao2，ZHANGXiao-feng1*

1.ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine，Shanghai200071

2.CollegeofLifeScience，EastChinaNormalUniversity，Shanghai200241

【Abstract】

Objective： To study the effect of REGγ on mouse spermatogenisis.

Methods： The expression of REGγ in mouse testis was detected by using Western blot. The spermatogonial stem cells was isolated by enzymatic digestion method. The expression of c-kit and α6-integrin in spermatogonial stem cells were detected by using flow cytometry. The sperm concentration and motility of REGγ knockout mouse were analyzed by computer assisted sperm analysis system. The fertility of offspring of REGγ knockout and wild type mouse was investigated by mating experiment.

Results： REGγ was highly expressed in mouse testis. About 70% purity of spermatogonial stem cells were obtained by enzymatic digestion method. The expression of c-kit and α6-integrin in spermatogonial stem cells from knockout mice was significant lower than that from wild type mice (P<0.05). Besides，both sperm concentration (37.1×106/ml vs. 75.4×106/ml)and sperm motility (54% vs. 74%) in knockout mice were significantly lower in REGγ wild type mice (P<0.05). The numbers of offspring of REGγ knockout of REGγ mice were significantly less than that of wild type male mice (P<0.05).

Conclusions： REGγ is involved in regulation of spermatogenisis.

Key words：REGγ；Spermatogenesis；Spermatogonial stem cells

【作者簡介】李寧，男，河北保定人，碩士，工程師，發(fā)育生物學(xué)專業(yè).(*通訊作者)

【基金項(xiàng)目】上海市自然科學(xué)基金國際合作項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：14430712100)

【收稿日期】2015-09-09；【修回日期】2015-10-13

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.009