阿魏酸鈉對(duì)肝纖維化大鼠脂肪干細(xì)胞移植存活率及治療作用的影響

岳冒易，劉廣益，鄒禮樂，韓藝，王巧稚

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州446000)

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阿魏酸鈉對(duì)肝纖維化大鼠脂肪干細(xì)胞移植存活率及治療作用的影響

岳冒易，劉廣益，鄒禮樂，韓藝，王巧稚

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州446000)

摘要：目的觀察阿魏酸鈉對(duì)肝纖維化大鼠脂肪干細(xì)胞(ASCs)移植存活率及治療作用的影響。方法選取小鼠50只，予CCl4腹腔注射8周制作肝纖維化模型，將造模成功的40只隨機(jī)分為A、B、C、D組各10只。A組生理鹽水灌胃并經(jīng)尾靜脈注射細(xì)胞培養(yǎng)基，B、D組予阿魏酸鈉100 mg/kg灌胃1次/d，C、D組經(jīng)尾靜脈行綠色熒光蛋白標(biāo)記的ASCs移植5×105/只，B、C組分別給予尾靜脈注射細(xì)胞培養(yǎng)基、生理鹽水灌胃，另取10只(E組)不造模且不做任何處理。4周后，檢測(cè)血清肝功能指標(biāo)，行Masson染色觀察肝組織病理，免疫組化法檢測(cè)肝組織中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)肝組織內(nèi)存活A(yù)SCs數(shù)量。結(jié)果 血清ALT、AST水平A組>B、C、D組>E組，ALB水平E組>A～D組、B組>A組，P均<0.05；A組膠原沉積最多，B、C組較多，D組次之，E組最少；肝組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)量A組>B組>C組>D組>E組，P均<0.05；C、D組ASCs存活數(shù)量比較，P>0.05。結(jié)論ASCs移植聯(lián)合阿魏酸鈉不能明顯增加肝內(nèi)ASCs存活數(shù)量，但較單一治療肝纖維化效果更好。

關(guān)鍵詞：肝纖維化；脂肪干細(xì)胞；阿魏酸鈉；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1

肝纖維化是各種慢性肝損傷常見的可逆病理過程，肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化、增殖并生成大量膠原是其中心環(huán)節(jié)[1]。脂肪干細(xì)胞(ASCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的一種，具有與骨髓MSCs相似[2]的分化能力和分泌功能，且易于獲取。有研究證實(shí)，ASCs移植對(duì)肝纖維化具有較好的治療作用[3～5]。阿魏酸是中藥當(dāng)歸的主要單體成分之一，具有抗炎、抑制血小板聚集等作用。阿魏酸鈉作為阿魏酸的成品藥物，臨床已廣泛用于心血管疾病的治療。有研究證實(shí)，阿魏酸鈉具有抗纖維化、抗炎、抗氧化作用[6～9]。研究表明，損傷部位的炎癥、氧化應(yīng)激微環(huán)境是影響MSCs體內(nèi)存活的重要因素。如行ASCs移植的同時(shí)應(yīng)用阿魏酸鈉治療，可否同時(shí)提高抗纖維化作用以及ASCs肝內(nèi)的存活率，尚不明確。2015年2～10月，我們觀察了兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝纖維化的治療作用以及對(duì)ASCs存活情況的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(25±3)g，由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的小鼠ASCs及其完全培養(yǎng)基，均購(gòu)自賽業(yè)(廣州)公司；阿魏酸鈉(AR級(jí))購(gòu)自西亞試劑公司，CCl4(AR級(jí))、橄欖油(AR級(jí))購(gòu)自成都科龍化工試劑廠； ALT、AST、ALB分析試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；免疫組化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗購(gòu)自Bioworld公司，免疫組化二抗、染色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Masson三色染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與造模處理選取小鼠50只，予40% CCl4腹腔注射2 mL/kg，2次/周，共8周。造模中死亡3只，第8周末隨機(jī)處死7只，取肝臟相同部位，Masson三色染色及免疫組化檢查提示建模成功[10]。將剩余40只隨機(jī)分為A、B、C、D組各10只，A組生理鹽水灌胃并經(jīng)尾靜脈注射培養(yǎng)基，B、D組予阿魏酸鈉100 mg/kg灌胃1次/d[11]，C、D組經(jīng)尾靜脈行綠色熒光蛋白標(biāo)記的ASCs移植5×105/只，B、C組分別給予尾靜脈注射培養(yǎng)基、生理鹽水灌胃。另取10只(E組)不造模且不做任何處理。

1.2.2肝功能檢測(cè)細(xì)胞移植后第4周，心臟穿刺取血制備血清，并檢測(cè)血清ALT、AST、ALB。

1.2.3肝組織病理檢查 取血后處死小鼠，取肝臟組織；多聚甲醛固定，石蠟切片。按試劑盒操作行Masson染色，光鏡下觀察各組膠原纖維增生情況。

1.2.4肝組織TGF-β1、α-SMA檢測(cè)取小鼠肝臟組織，多聚甲醛固定，石蠟切片；一抗稀釋100倍，按試劑盒說明書行TGF-β1、α-SMA免疫組化染色。光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，相同條件下拍照；使用IPP 6.0軟件行圖片分析，測(cè)量積分光密度值(IOD)，以此表示蛋白表達(dá)量。

1.2.5ASCs存活情況觀察分別取C、D組新鮮肝組織冰凍，OTC膠水包埋后行冰凍切片；熒光顯微鏡下(×100)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)帶綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，并求取均數(shù)，即為ASCs存活數(shù)量。

2結(jié)果

2.1各組血清ALT、AST、ALB比較 見表1。

表1　各組血清ALT、AST、ALB比較

注：與E組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05。

2.2肝組織病理檢查結(jié)果A組壞死擴(kuò)大的門管區(qū)縮小，膠原沉積最多，部分膠原沉積部位有肝細(xì)胞填補(bǔ)。B組擴(kuò)大的門管區(qū)縮小，門管區(qū)及纖維間隔的膠原量相比A組明顯減少。C組膠原已不呈連續(xù)條帶狀，變細(xì)、變短，散在分布于門管區(qū)和小葉間。D組門管區(qū)縮小，膠原量較C組進(jìn)一步減少，小葉間纖維間隔基本消失，僅見門管區(qū)有少量膠原沉積。E組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，小葉內(nèi)及門管區(qū)未見纖維沉積。

2.3各組肝組織TGF-β1、α-SMA表達(dá)比較 見表2。

表2　各組肝組織TGF-β1、α-SMA表達(dá)(IOD值)

注：與E組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與D組比較，○P<0.05。

2.4C、D組ASCs肝內(nèi)存活情況C、D組ASCs數(shù)量分別為(65.2±15.68)、(62.9±20.06)個(gè)/HP，P>0.05。

3討論

在各種有害刺激作用下，HSCs活化增殖，大量合成膠原纖維，導(dǎo)致肝內(nèi)膠原合成與降解的平衡被打破，是肝纖維化病理的中心環(huán)節(jié)。多種細(xì)胞因子在肝纖維化的進(jìn)展中起作用，而TGF-β1是最重要的促進(jìn)HSCs活化增殖的細(xì)胞因子。在各種肝臟損傷因素作用下，TGF-β1被大量分泌，通過TGF-β1/Samd信號(hào)通路活化并促進(jìn)HSCs的增殖；活化后的HSCs表達(dá)α-SMA，使α-SMA 成為重要的活化后HSCs的標(biāo)志物[1]?；罨蟮腍SCs能自分泌和旁分泌TGF-β1，繼續(xù)這一活化增殖過程；即使去除最初的肝損傷因素，也能維持纖維化發(fā)展[1]。MSCs移植對(duì)肝纖維化的治療作用主要包括[2]：①M(fèi)SCs可分化為有功能的肝細(xì)胞，補(bǔ)充肝細(xì)胞數(shù)量；②MSCs通過分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子起到保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞再生，抑制HSCs活化增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。因此，如何提高移植后干細(xì)胞存活率和增強(qiáng)其旁分泌作用具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸鈉具有抗細(xì)胞膜脂過氧化、降低肝硬化患者門脈壓力、抑制HSCs增殖和膠原合成的作用[12～14]。CCl4腹腔注射是經(jīng)典的肝纖維化模型制備方法，但停藥后肝纖維化可自發(fā)逆轉(zhuǎn)，且與停藥時(shí)間呈正相關(guān)[15]。本研究顯示，B、C、D組與A組相比，血清肝功能及肝組織纖維沉積量、TGF-β1、α-SMA表達(dá)量均有所下降，且D組變化更明顯。表明兩種處理都具有一定的治療作用，且聯(lián)合治療的作用優(yōu)于單獨(dú)治療。有文獻(xiàn)顯示，MSCs移植能降低肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)量和活化HSCs數(shù)量[2]，而阿魏酸鈉能夠減少肝內(nèi)α-SMA表達(dá)量[6]。因HSCs是肝纖維化時(shí)TGF-β1的重要來源，故阿魏酸鈉稍微降低TGF-β1的作用可能通過減少活化HSCs數(shù)量來間接實(shí)現(xiàn)的。但本研究發(fā)現(xiàn)，D組較C組肝內(nèi)ASCs 存活數(shù)量并未明顯提高。我們推斷，阿魏酸鈉灌胃聯(lián)合ASCs移植對(duì)肝纖維化的治療作用可能并不是最初設(shè)想的通過提高ASCs的存活率來實(shí)現(xiàn)，而可能僅是兩種治療作用的單純疊加，或通過復(fù)雜的過程提高了ASCs的旁分泌作用，這需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。但是，即使只是單純的治療作用的疊加，對(duì)于未來可能的臨床肝纖維化ASCs移植治療，仍然具有積極的意義。

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Influence of sodium ferulate on survival rate of adipose-derived stem cell transplantation and therapeutic effect in mice with hepatic fibrosis

YUEMaoyi,LIUGuangyi,ZOUliyue,HANYi,WANGQiaozhi

(SichuanMedicalUniversity,Luzhou446000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the influence of sodium ferulate on the survival rate of the transplanted adipose tissue-derived stem cells (ASCs) and the therapeutic effect in mice with hepatic fibrosis. MethodsFifty mice were selected to make the liver fibrosis models through CCl4 injection intraperitoneally for 8 weeks, and then 40 mice with hepatic fibrosis were randomly divided into groups A， B, C and D. Mice in the group A were administered with saline daily by gavage and then injected with cell culture medium by tail vein. Mice in the groups B and D were given 100 mg/kg sodium ferulate by lavage. Mice in the groups C and D received the GFP labeled ASCs (5×105) injection. The groups B and D were injected to the caudal veins of mice with cell culture medium and were also gavaged with normal saline. Ten mice (group E) were selected as the control group without any treatment. After 4 weeks, the liver function index was detected, the pathology of liver tissues was observed by Masson staining, the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), α-smooth muscle actin (α-SMA) in the liver tissues was determined by immunohistochemistry, and the number of ASCs in liver were detected by fluorescence microscope. ResultsALT and AST serum levels: group A >groups B, C and D > group E (P<0.05). ALB serum levels: group E > groups A, B, C and D, group B>group A (P<0.05). Collagen deposition: group A >groups B and C > group D > group E. Expression of TGF-β1 and α-SMA: group A > group B >group C>group D > group E (P<0.05). There was no significant difference in survival rate between group C and group D (P>0.05). ConclusionThe combined application of sodium ferulate and ASCs can not significantly increase the survival rate of transplanted ASCs in liver, but has a better therapeutic effect as compared with the separated application.

Key words:liver fibrosis; adipose-derived stem cell; sodium ferulate; transforming growth factor-β1

(收稿日期：2015-10-24)

中圖分類號(hào)：R575

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)10-0010-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.004

通信作者簡(jiǎn)介：王巧稚(1978-)，女，副教授，主要研究方向?yàn)楦杉?xì)胞應(yīng)用。E-mail: wqz416@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一岳冒易(1987-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)楦杉?xì)胞應(yīng)用。E-mail: 759840575@qq.com

基金項(xiàng)目：四川省科技廳市校聯(lián)合項(xiàng)目(2014TSX-0119)。