野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法研究進(jìn)展

史雪威,張晉東,歐陽(yáng)志云

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085 2 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南充 637009 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法研究進(jìn)展

史雪威1,3,張晉東2,歐陽(yáng)志云1,*

1 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100085 2 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南充 637009 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是中國(guó)特有珍稀野生動(dòng)物,被譽(yù)為野生動(dòng)物保護(hù)領(lǐng)域的“旗艦物種”。大熊貓種群數(shù)量的變化可以實(shí)時(shí)反應(yīng)大熊貓種群動(dòng)態(tài),提供大熊貓分布區(qū)域、棲息地質(zhì)量等最直接的信息,是制定大熊貓保護(hù)方案的基礎(chǔ),也是有效實(shí)施大熊貓保護(hù)措施的前提。綜述了幾種傳統(tǒng)野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法(包括直接計(jì)數(shù)法、數(shù)學(xué)模型法、距離-咬節(jié)分析法及分子生物學(xué)方法),以及近年來(lái)最新應(yīng)用于野生動(dòng)物種群數(shù)量調(diào)查的紅外相機(jī)技術(shù)、足跡鑒定法,討論了傳統(tǒng)方法中可能存在的問(wèn)題、分析新方法的應(yīng)用前景,并針對(duì)今后的野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查提出了一些建議與展望。

大熊貓;種群數(shù)量調(diào)查方法;距離-咬節(jié)分析法;分子生物學(xué)方法;紅外相機(jī)技術(shù);足跡鑒定法

種群數(shù)量是動(dòng)物生態(tài)學(xué)、行為生態(tài)學(xué)和資源管理學(xué)最核心的問(wèn)題之一,通過(guò)種群數(shù)量調(diào)查可以有效的掌握種群動(dòng)態(tài)、種群生活史及進(jìn)化對(duì)策、種群棲息地狀況[1]。種群的婚配制度、繁殖策略、繁殖行為的表達(dá)也與種群數(shù)量調(diào)查密切相關(guān)[2]。種群數(shù)量的變化可以評(píng)價(jià)瀕危物種的保護(hù)措施對(duì)種群恢復(fù)的作用,資源管理部門(mén)亦可以依據(jù)種群數(shù)量的調(diào)查結(jié)果制訂有效的保護(hù)管理計(jì)劃。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是中國(guó)特有珍稀野生動(dòng)物,有“國(guó)寶”和“活化石”之稱(chēng),被譽(yù)為野生動(dòng)物保護(hù)領(lǐng)域的“旗艦物種”,歷史上,大熊貓?jiān)鴱V泛分布于我國(guó)南部、中部、西南,向北直到北京周口店等,向南至緬旬北部[3]。然而由于地質(zhì)、氣候的變遷,特別是近代以來(lái)人類(lèi)活動(dòng)范圍的不斷擴(kuò)大和對(duì)森林資源的過(guò)度利用,大熊貓面臨種群隔離、遺傳多樣性降低以致滅絕的危險(xiǎn)[4]。

大熊貓種群數(shù)量調(diào)查可以實(shí)時(shí)反應(yīng)大熊貓種群動(dòng)態(tài)變化,提供大熊貓分布、棲息地狀況等最直接的信息,是制定及有效實(shí)施大熊貓保護(hù)措施的前提。為得到大熊貓種群數(shù)量等信息,建國(guó)以來(lái),國(guó)家林業(yè)局先后組織4次全國(guó)大熊貓調(diào)查,最近的調(diào)查結(jié)果顯示截至2013年底,全國(guó)野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1864只(表1),比第三次調(diào)查增加268只,增長(zhǎng)16.8%[5]。

表1 歷次全國(guó)大熊貓調(diào)查總結(jié)

大熊貓生活在高山峽谷的密林竹叢中,棲息地地形復(fù)雜;同時(shí)大熊貓種群密度低,其行動(dòng)也十分隱蔽,對(duì)人類(lèi)的警惕性很高,在野外很難觀察到它的實(shí)體,因此許多陸棲動(dòng)物的數(shù)量調(diào)查方法不能運(yùn)用于大熊貓種群數(shù)量調(diào)查[6]。為了得到野生大熊貓數(shù)量及分布的確切數(shù)據(jù),科研工作人員先后采用直接計(jì)數(shù)法、數(shù)學(xué)模型法、路線調(diào)查法、距離區(qū)分法和咬節(jié)區(qū)分法、分子生物學(xué)方法等多種方法對(duì)野生大熊貓種群數(shù)量進(jìn)行調(diào)查。歷次大熊貓種群數(shù)量調(diào)查均花費(fèi)高額費(fèi)用,調(diào)動(dòng)大量人力、物力參與其中,但由于種種原因,其所得結(jié)果常為后人所質(zhì)疑。目前大熊貓種群調(diào)查方法依然缺乏一種同時(shí)具備客觀性、非損傷性、精確度高、投入產(chǎn)出比高、可實(shí)踐性強(qiáng)大熊貓種群調(diào)查方法。本文對(duì)大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法進(jìn)展進(jìn)行綜述,梳理野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法,討論方法中可能存在的問(wèn)題,并探討了今后的野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法的發(fā)展方向。

1 野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法

野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法大體上可分為兩種：直接統(tǒng)計(jì)方法和間接統(tǒng)計(jì)方法。

1.1 直接統(tǒng)計(jì)方法

直接統(tǒng)計(jì)方法主要包括直接計(jì)數(shù)法和數(shù)學(xué)模型法,其核心思想是通過(guò)布設(shè)調(diào)查路線、樣方等直接對(duì)野生大熊貓直接進(jìn)行觀察,根據(jù)實(shí)際觀察到的野生大熊貓數(shù)量估算樣方內(nèi)密度,進(jìn)而推算研究區(qū)域內(nèi)總體數(shù)量。

1.1.1 直接計(jì)數(shù)法

1968年,我國(guó)首次野外大熊貓調(diào)查,采用直接計(jì)數(shù)法(又名哄趕法或圍趕法)調(diào)研了四川省平武縣王朗自然保護(hù)區(qū)的大熊貓數(shù)量[7]。調(diào)查步驟如下：(1)調(diào)查目標(biāo)動(dòng)物的主要棲息地并選好調(diào)查樣地;(2)在樣地內(nèi)對(duì)目標(biāo)動(dòng)物進(jìn)行哄趕并計(jì)數(shù);(3)計(jì)算調(diào)查樣地內(nèi)目標(biāo)動(dòng)物棲息密度;(4)根據(jù)樣地占研究區(qū)面積比例,推算研究區(qū)域內(nèi)目標(biāo)動(dòng)物種群數(shù)量。

王朗自然保護(hù)區(qū)大熊貓調(diào)查組選擇兩條比較小又具有代表性的山溝(機(jī)械工棚溝和澡堂溝)作為樣地,分兩路攜帶獵犬由溝底小溪兩側(cè)向上搜索驅(qū)趕,間隔一定距離統(tǒng)計(jì)所發(fā)現(xiàn)大熊貓實(shí)體數(shù)量,依據(jù)樣地面積,計(jì)算大熊貓?jiān)谟辛值孛娣e和箭竹叢面積中的棲息密度,然后根據(jù)有林地面積和箭竹叢面積所占保護(hù)區(qū)的百分比,推算出保護(hù)區(qū)大熊貓的種群數(shù)量。

直接計(jì)數(shù)比較原始,數(shù)量統(tǒng)計(jì)精確度也較低,僅適用于對(duì)大型動(dòng)物的調(diào)查,例如有蹄類(lèi)動(dòng)物的數(shù)量[8],能在一定意義上說(shuō)明該區(qū)域存在野生大熊貓。直接計(jì)數(shù)法人力物力花費(fèi)較大,對(duì)大熊貓的驚擾較嚴(yán)重,野外觀測(cè)時(shí)存在重復(fù)計(jì)數(shù)和漏計(jì)問(wèn)題,現(xiàn)該方法已被淘汰[6]。

1.1.2 數(shù)學(xué)模型法

1988年,北京大學(xué)、陜西長(zhǎng)青林業(yè)局聯(lián)合大熊貓研究小組在出版的《秦嶺大熊貓的自然庇護(hù)所》一書(shū)中提出了用數(shù)學(xué)模型推導(dǎo)在針闊葉混交林-巴山木竹林-大熊貓生態(tài)系統(tǒng)中大熊貓種群密度的方法[9]。模型為：

式中,P為單位面積內(nèi)熊貓的平均數(shù)量,即密度(只/km2);T為單位面積內(nèi)所設(shè)立的一個(gè)樣方的面積(km2);V為一個(gè)觀測(cè)時(shí)間單位中,在一個(gè)樣方里觀察到熊貓的平均數(shù)量(只·樣方面積-1·觀測(cè)時(shí)間-1);K為在一個(gè)觀測(cè)時(shí)間中,一只熊貓可能獨(dú)立進(jìn)入一個(gè)樣方的次數(shù)。

式中,T值選取依據(jù)竹林中能見(jiàn)度的最大范圍,K值根據(jù)大熊貓?jiān)谟^測(cè)時(shí)間內(nèi)的移動(dòng)范圍與樣方面積的比值得出。

為了驗(yàn)證此模型的精確性,調(diào)查組利用數(shù)學(xué)模型法于1985年對(duì)佛坪自然保護(hù)區(qū)三官?gòu)R地區(qū)、1986年對(duì)長(zhǎng)青林業(yè)局華陽(yáng)林場(chǎng)境內(nèi)的大熊貓數(shù)量進(jìn)行調(diào)查,得出與以往調(diào)查資料相近的結(jié)果。

數(shù)學(xué)模型法是一種簡(jiǎn)單易行的種群調(diào)查方法,調(diào)查人員只需記錄路線長(zhǎng)度、樣方數(shù)、直觀熊貓數(shù)等數(shù)據(jù)即可依據(jù)模型估算區(qū)域內(nèi)熊貓數(shù)量。但野外直接觀察到大熊貓實(shí)體十分困難,而且大熊貓往往會(huì)通過(guò)敏銳的嗅覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)率先發(fā)現(xiàn)調(diào)查者并改變?cè)械男羞M(jìn)路線,這種行進(jìn)路線的改變是否會(huì)造成直觀大熊貓重復(fù)計(jì)數(shù)有待于進(jìn)一步的調(diào)查。另外,在大熊貓的不同生境下,竹林密度會(huì)有所差異,因此竹林中能見(jiàn)度的最大范圍相應(yīng)不同,即T值不同。模型參數(shù)較多為推測(cè),模型存在一定的模糊性和不確定性。

1.2 間接統(tǒng)計(jì)方法

由于大熊貓棲息地地形復(fù)雜,大熊貓活動(dòng)隱秘,不容易直接定位、觀察野生大熊貓個(gè)體,目前對(duì)野生大熊貓的監(jiān)測(cè)、數(shù)量調(diào)查工作常通過(guò)對(duì)大熊貓活動(dòng)產(chǎn)生的衍生物(如糞便等)進(jìn)行分析,間接統(tǒng)計(jì)大熊貓數(shù)量。間接統(tǒng)計(jì)方法包括路線調(diào)查法、距離分析法和咬節(jié)區(qū)分法以及分子生物學(xué)調(diào)查法。

1.2.1 路線調(diào)查法

路線調(diào)查法在大熊貓調(diào)查中有著較長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用,1974年—1977年開(kāi)展的四川省大熊貓等珍稀動(dòng)物調(diào)查(即全國(guó)第一次大熊貓調(diào)查)采用了路線法。路線調(diào)查法簡(jiǎn)稱(chēng)路線法,又名樣線法,是一種在預(yù)先劃定的調(diào)查區(qū)域內(nèi)布設(shè)調(diào)查路線收集大熊貓活動(dòng)各種信息的方法,適用于分布面積廣、無(wú)法進(jìn)行徹底調(diào)查的動(dòng)物[10]。調(diào)查步驟如下：(1)通過(guò)查閱資料、走訪當(dāng)?shù)卮迕竦却_定重點(diǎn)調(diào)查區(qū)和一般調(diào)查區(qū);(2)根據(jù)調(diào)查區(qū)域內(nèi)地形地貌、植被狀況、竹類(lèi)分布狀況、大熊貓的生態(tài)習(xí)性等劃分調(diào)查小區(qū),布設(shè)調(diào)查路線;(3)調(diào)查人員依據(jù)調(diào)查路線收集、記錄大熊貓活動(dòng)的各種信息[3]。調(diào)查路線布設(shè)的原則是：保證調(diào)查路線盡可能多地穿過(guò)大熊貓活動(dòng)的各種生境(包括溝谷、山坡、山梁等),收集的信息能夠有效代表該調(diào)查小區(qū)[11]。

全國(guó)第一次大熊貓調(diào)查過(guò)程中,調(diào)查人員在岷山、邛崍山、涼山、相嶺及秦嶺南坡中段等大熊貓棲息地內(nèi),按“V”字形進(jìn)行搜索,記錄遇到的大熊貓實(shí)體以及各種新鮮活動(dòng)痕跡(如糞便、咬痕、臥穴、足跡等)。統(tǒng)計(jì)分析時(shí),只以新鮮糞便為指標(biāo)(陳舊糞便不作統(tǒng)計(jì)),將新鮮糞便的直徑、組成成分、消化狀況、咬節(jié)長(zhǎng)度等作為區(qū)分大熊貓個(gè)體的重要依據(jù)。指標(biāo)相同則視為同一只個(gè)體,否則視為不同個(gè)體[12]。在這次調(diào)查中,咬節(jié)長(zhǎng)度雖然作為區(qū)分大熊貓個(gè)體的指標(biāo)之一得到應(yīng)用,但區(qū)分咬節(jié)長(zhǎng)度的判別標(biāo)準(zhǔn)較為粗糙(沒(méi)有設(shè)置區(qū)分閾值),后經(jīng)完善逐步形成了系統(tǒng)的咬節(jié)區(qū)分法。

路線調(diào)查法是一種原理簡(jiǎn)單、容易推廣和易于操作的方法,同時(shí)也是是其他調(diào)查方法的基礎(chǔ)。通過(guò)路線調(diào)查法可以收集到野生大熊貓的相關(guān)信息,這些信息不但可以用于分析大熊貓的種群數(shù)量和分布范圍,還囊括了大熊貓棲息地及潛在棲息地受干擾狀況。但第一次全國(guó)大熊貓調(diào)查中應(yīng)用的路線法過(guò)多依靠調(diào)查人員的主觀視覺(jué)評(píng)價(jià)(例如對(duì)大熊貓實(shí)體大小、糞便新鮮程度的判斷等),不同調(diào)查人員之間調(diào)查結(jié)果存在較大差異,所得數(shù)量?jī)H供參考。

大熊貓調(diào)查工作目前細(xì)化分為外業(yè)調(diào)查方法和內(nèi)業(yè)分析方法。在現(xiàn)階段研究工作中,路線調(diào)查法常作為外業(yè)調(diào)查方法一種,收集所需要的資料。全國(guó)第三次大熊貓調(diào)查外業(yè)調(diào)查即采取拉網(wǎng)式路線調(diào)查法,首要搜集大熊貓的糞便,作為分析大熊貓種群數(shù)量的依據(jù)[11]。

1.2.2 距離區(qū)分法和咬節(jié)區(qū)分法

1999—2003年全國(guó)第三次大熊貓調(diào)查外業(yè)調(diào)查采取拉網(wǎng)式路線調(diào)查法收集大熊貓活動(dòng)的各種信息,而內(nèi)業(yè)分析方法采用距離區(qū)分法和咬節(jié)區(qū)分法結(jié)合綜合分析大熊貓種群數(shù)量。內(nèi)業(yè)分析方法具體為：(1)首先利用距離區(qū)分法初步區(qū)分。通過(guò)GIS軟件計(jì)算出任意兩處痕跡點(diǎn)之間的距離,將此距離與區(qū)分閾值進(jìn)行比較,如果距離大于區(qū)分閾值,則將其區(qū)分為兩個(gè)不同個(gè)體。(2)再利用咬節(jié)區(qū)分法進(jìn)一步區(qū)分。對(duì)于小于距離區(qū)分閾值的痕跡點(diǎn)集合,則計(jì)算不同痕跡點(diǎn)的咬節(jié)平均值之差,通過(guò)與咬節(jié)區(qū)分閾值比較,進(jìn)行個(gè)體識(shí)別(圖1)[11]。

距離區(qū)分法是指當(dāng)兩個(gè)痕跡點(diǎn)之間的間距超出一定范圍時(shí),可基本判斷這兩個(gè)痕跡點(diǎn)不屬于同一只大熊貓。大熊貓屬于獨(dú)棲動(dòng)物,除繁殖季節(jié)外,野生大熊貓間常保持著一定距離,每只大熊貓通過(guò)嗅覺(jué)主動(dòng)回避其他個(gè)體的近日活動(dòng)范圍[13],除了發(fā)情期和季節(jié)性垂直遷移期及突發(fā)事件(如冷箭竹開(kāi)花、地震)外,野生大熊貓基本都在一個(gè)有限的區(qū)域內(nèi)攝食、飲水或?qū)ふ遗渑?這個(gè)區(qū)域即巢域(家域)[14],如果兩個(gè)痕跡點(diǎn)間距不在這個(gè)范圍內(nèi),那么它們屬于同一只大熊貓的概率就變得很低。另外大熊貓為節(jié)省能量消耗不愛(ài)走動(dòng),日移動(dòng)直線平均距離不到500m[3]。由于大熊貓?jiān)谝欢〞r(shí)間內(nèi)的移動(dòng)距離是相對(duì)穩(wěn)定的,大熊貓很可能只出現(xiàn)在一個(gè)以某一痕跡點(diǎn)為圓心,該時(shí)間段內(nèi)大熊貓最遠(yuǎn)移動(dòng)距離為半徑的區(qū)域內(nèi)。因此如果兩個(gè)痕跡點(diǎn)之間的距離超過(guò)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)痕跡點(diǎn)的時(shí)間間隔段內(nèi)大熊貓最遠(yuǎn)移動(dòng)距離(距離區(qū)分閾值),基本上可以判斷這兩個(gè)痕跡點(diǎn)不屬于同一只大熊貓所留。全國(guó)第三次大熊貓調(diào)查中采用的距離區(qū)分閾值分別為：1d為D1=1.0km;1—3d為D3=1.5km;4—15d為D7=2.5km;15d以上為DMAX=3.5km[11]。

圖1 第三次全國(guó)大熊貓調(diào)查大熊貓種群數(shù)量分析流程圖[11]Fig.1 The flow chart of Giant Panda population analysis in The Third Nation′s Giant Panda Survey[11]

采用距離區(qū)分法時(shí),對(duì)于大尺度上距離顯著大于區(qū)分閾值的兩處痕跡點(diǎn)是很容易區(qū)分開(kāi)來(lái)的,但是對(duì)于在小尺度上距離小于或接近區(qū)分閾值的兩處痕跡點(diǎn)的區(qū)分能力不強(qiáng)。Zhang等對(duì)陜西省佛坪自然保護(hù)區(qū)的4只野生大熊貓GPS追蹤發(fā)現(xiàn),大熊貓冬季巢域范圍顯著大于夏季巢域范圍,并且不同的野生大熊貓家域之間存在很高程度的巢域重疊現(xiàn)象[15]。距離區(qū)分閾值同日行走距離密切相關(guān),而大熊貓日行走距離受繁殖因素、尋找食物難易程度等多方面因素影響,不同個(gè)體、季節(jié)有很大差異,日行走距離很難有一個(gè)確定的數(shù)字[16]。胡錦矗等通過(guò)無(wú)線電監(jiān)測(cè)測(cè)定四川臥龍保護(hù)區(qū)大熊貓每天活動(dòng)平均約為600—1500m左右,移動(dòng)的直線距離不超過(guò)500m;潘文石等通過(guò)無(wú)線電項(xiàng)圈對(duì)秦嶺6只大熊貓日?；顒?dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)任何個(gè)體在同一個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)的遷移距離都存在很大差別,并且30d內(nèi)同一個(gè)體遷移距離隨時(shí)間間隔的增加其平均距離也增大[10];Zhang等對(duì)臥龍自然保護(hù)區(qū)5只野生大熊貓的監(jiān)測(cè)顯示大熊貓日活動(dòng)范圍在(241±341)m。目前大熊貓移動(dòng)距離、巢域大小等多利用無(wú)線電監(jiān)測(cè)進(jìn)行,通過(guò)判斷信號(hào)強(qiáng)弱以確定目標(biāo)個(gè)體的方位。但山區(qū)地形復(fù)雜、植被豐富,無(wú)線電信號(hào)反射現(xiàn)象較為嚴(yán)重,而且定位目標(biāo)個(gè)體方位易受監(jiān)測(cè)者主觀意識(shí)影響,因此可能存在較大的定位誤差[4],現(xiàn)在GPS追蹤的應(yīng)用揭示了比無(wú)線電項(xiàng)圈更廣的大熊貓家域和活動(dòng)核心區(qū)域[16,17]。距離區(qū)分閾值常采用調(diào)查時(shí)期內(nèi)的大熊貓平均最遠(yuǎn)移動(dòng)距離,因此分析出的大熊貓種群數(shù)量是一個(gè)保守的數(shù)字。另外,大熊貓?jiān)诳臻g利用上存在顯著的互相影響。Hull等發(fā)現(xiàn)1個(gè)熊貓對(duì)(由1只雄性和兩只雌性大熊貓組成)的疊合巢域同時(shí)顯著吸引熊貓對(duì)里的3只大熊貓(即熊貓對(duì)里3只大熊貓會(huì)同時(shí)出現(xiàn)在他們的疊合巢域內(nèi))[17]。僅通過(guò)痕跡點(diǎn)之間的距離就判斷是否為1只大熊貓值得商榷,大熊貓行為生態(tài)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展將有助于距離區(qū)分法的改進(jìn)與應(yīng)用。

20世紀(jì)80年代以來(lái),咬節(jié)區(qū)分法作為判斷大熊貓種群數(shù)量的重要方法之一得到了廣泛的應(yīng)用。咬節(jié)(Bamboo Stem Fragments)即為大熊貓糞便中未消化的竹莖,普遍認(rèn)為具有個(gè)體特征[3]。對(duì)糞便中的咬節(jié)長(zhǎng)度進(jìn)行多元方差分析,可以區(qū)分相鄰樣線上不同個(gè)體,進(jìn)而得出區(qū)域內(nèi)大熊貓數(shù)量。尹玉峰等提出目前使用的咬節(jié)區(qū)分法閾值(2mm)可較準(zhǔn)確判斷大熊貓種群數(shù)量[18]。

用咬節(jié)區(qū)分個(gè)體的前提是在野外,大熊貓彼此間隔離,區(qū)域范圍內(nèi)數(shù)量很少的情況下進(jìn)行。在較大區(qū)域上,由于會(huì)存在更多的年齡相同或相仿、咀嚼能力接近的大熊貓個(gè)體,彼此之間咬節(jié)平均長(zhǎng)度有可能差異不顯著[3]。同時(shí)大熊貓食性存在季節(jié)性變化,在某些季節(jié)全采食竹葉而在其糞便中不留下咬節(jié),因此咬節(jié)區(qū)分法具有一定時(shí)間局限性[19]。另外,咬節(jié)區(qū)分法判斷兩只個(gè)體所使用的平均咬節(jié)長(zhǎng)度差別閾值是1.5mm或2mm(如第三次全國(guó)大熊貓調(diào)查),這對(duì)測(cè)量的精度要求很高,容易受到主觀因素和測(cè)量誤差的影響[20]。2003年魏榮平等對(duì)臥龍自然保護(hù)區(qū)中的15只不同年齡(2—16歲)大熊貓糞便中的竹子咬節(jié)進(jìn)行了測(cè)定,通過(guò)竹子咬節(jié)平均值的方差分析,發(fā)現(xiàn)糞便中竹子咬節(jié)長(zhǎng)短受個(gè)體、日期及它們的交互作用影響,與年齡、性別,山系,野外和飼養(yǎng)環(huán)境都沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系,也易受環(huán)境(日期,竹子質(zhì)量等許多不清楚的因素)的影響[21]。因此通過(guò)咬節(jié)法所得到的數(shù)量調(diào)查結(jié)果存在爭(zhēng)議。

第三次全國(guó)大熊貓調(diào)查對(duì)大熊貓種群數(shù)量的分析,采用距離區(qū)分法和咬節(jié)區(qū)分法相結(jié)合的綜合分析方法[11]。調(diào)查結(jié)果顯示,目前野外共有1596只大熊貓(不包括1.5歲以下大熊貓幼體數(shù)量)。為了使調(diào)查數(shù)據(jù)更具有可比性,第四次調(diào)查基本上沿用了第三次調(diào)查采用的距離區(qū)分法和咬節(jié)區(qū)分法對(duì)種群數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示截至2013年年底,全國(guó)野生大熊貓種群數(shù)量達(dá)1864只,增加了268只,增長(zhǎng)了16.8%。

1.2.3 分子生物學(xué)調(diào)查法

近些年隨著分子生物學(xué)、保護(hù)遺傳學(xué)的發(fā)展,有專(zhuān)家陸續(xù)通過(guò)大熊貓DNA進(jìn)行個(gè)體識(shí)別,進(jìn)而統(tǒng)計(jì)大熊貓種群數(shù)量。其基本原理是：大熊貓糞便在經(jīng)消化道排出時(shí),會(huì)有部分脫落的細(xì)胞混雜在糞便表面的黏液中。提取脫落細(xì)胞的DNA全基因組,進(jìn)行個(gè)體遺傳信息的分析,區(qū)分不同大熊貓個(gè)體,最終統(tǒng)計(jì)種群數(shù)量(圖2)[22]。高等生物的基因組中含有大量的串聯(lián)重復(fù)序列,主要由兩種類(lèi)型組成,即小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA,對(duì)應(yīng)的采用的分子生物學(xué)遺傳標(biāo)記監(jiān)測(cè)技術(shù)分別為DNA指紋圖譜技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)。

圖2 分子生物學(xué)在大熊貓調(diào)查研究中的流程圖及應(yīng)用[22]Fig.2 Flow chart of genetics method and its application in the Giant Panda research[22]

小衛(wèi)星DNA是一些重復(fù)單位在11—60bp、重復(fù)次數(shù)在成百以上、總長(zhǎng)度由幾百至幾千個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列。DNA指紋圖譜技術(shù)是由DNA指紋探針產(chǎn)生的、多個(gè)RFLP圖帶組成的、具有高度變異性和個(gè)體專(zhuān)一性的,并能穩(wěn)定遺傳的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜[23]。DNA指紋圖譜技術(shù)利用多位點(diǎn)探針與基因組中的多個(gè)小衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因雜交,產(chǎn)生多態(tài)性圖帶,每條可分辨的圖帶代表一個(gè)等位基因位點(diǎn)。因此DNA指紋圖譜能夠全面地反應(yīng)基因組的變異性,具有高度的個(gè)體特異性。20世紀(jì)90年代,方盛國(guó)、馮和文等嘗試將DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于大熊貓數(shù)量調(diào)查,首次利用分子生物學(xué)技術(shù)判斷野生大熊貓種群數(shù)量。2006年余建秋建立了從大熊貓糞便樣品中提取高質(zhì)量DNA的技術(shù)體系,并得到清晰易辨的DNA指紋圖譜[24]。

DNA指紋圖譜技術(shù)具有可供分析圖帶多、并能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn),反映動(dòng)物的遺傳背景的變異程度更精確等優(yōu)點(diǎn),而且通過(guò)分級(jí)離心法可以有效降低糞便樣品中污染DNA含量[24]。但該技術(shù)存在著工作量大、帶型比較誤差大、提取DNA數(shù)量質(zhì)量的要求比較嚴(yán)格、成本相對(duì)較高、設(shè)備要求較多等缺點(diǎn)。

微衛(wèi)星DNA是指以1—6bp的短核苷酸序列為核心單位、長(zhǎng)度小于100bp的小片段,又稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats)。微衛(wèi)星DNA兩端的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列, 并且不同等位基因間的重復(fù)數(shù)存在豐富的差異,通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物,對(duì)基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用以揭示擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性(即微衛(wèi)星標(biāo)記)[25]。相對(duì)于其它分子標(biāo)記而言,微衛(wèi)星標(biāo)記具有分布廣泛、選擇中性、共顯性遺傳、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)。1997年張亞平等對(duì)大熊貓微衛(wèi)星初次進(jìn)行篩選并應(yīng)用于親子鑒定[26]。2006年詹祥江等人通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn),利用多個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行大熊貓的個(gè)體鑒定。在對(duì)四川王朗自然保護(hù)區(qū)大熊貓種群數(shù)量調(diào)查研究中,詹祥江等人得出結(jié)論共有66只大熊貓(35只雄性,31只雌性)生存,遠(yuǎn)高于全國(guó)第三次大熊貓調(diào)查中的27只[20]。2008年Wu Hua等發(fā)現(xiàn)可用于大熊貓非損傷取樣樣品分析的33個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)[27]。2010年在《Nature》雜志上公布的大熊貓基因組精細(xì)圖譜研究成果,為分子生物學(xué)鑒定個(gè)體提供便利[28]。2015年黃杰等人通過(guò)掃描大熊貓全基因組搜索和輸出微衛(wèi)星序列,進(jìn)一步對(duì)微衛(wèi)星序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,逐步篩選出糞便樣品中同時(shí)具備多態(tài)性、穩(wěn)定性、可重復(fù)性的四堿基微衛(wèi)星共15個(gè)建立大熊貓微衛(wèi)星標(biāo)記系統(tǒng),同時(shí)選擇此系統(tǒng)中期望雜合度最高的6個(gè)位點(diǎn)建立大熊貓個(gè)體識(shí)別方法[29]。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記克服了DNA指紋技術(shù)需求大量高質(zhì)量DNA的限制[20],但仍有以下問(wèn)題值得注意。微衛(wèi)星標(biāo)記具有種族特異性,通常需針對(duì)不同的物種,在了解其基因序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì),此過(guò)程包括基因文庫(kù)構(gòu)建、基因測(cè)序、引物設(shè)計(jì)與多態(tài)性檢測(cè)等,費(fèi)時(shí)費(fèi)力[30]。另外采用不同微衛(wèi)星標(biāo)記得出的不同結(jié)果之間很難橫向?qū)Ρ萚29]。微衛(wèi)星側(cè)翼序列變異會(huì)帶來(lái)等位基因大小同源異形和無(wú)效等位基因,對(duì)群體遺傳多樣性參數(shù)、親本分析結(jié)果等相關(guān)分析帶來(lái)不良影響[29]。同時(shí)微衛(wèi)星標(biāo)記在處理低濃度、少數(shù)量、污染DNA模板時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)等位基因丟失、錯(cuò)印等現(xiàn)象,引起種群數(shù)量統(tǒng)計(jì)上的偏差。設(shè)計(jì)恰當(dāng)基因分型實(shí)驗(yàn)方案、減少基因分型過(guò)程中的誤差、基因分型后的數(shù)據(jù)清理、數(shù)據(jù)分析時(shí)誤差說(shuō)明等可在很大程度上最終減少誤差[31]?，F(xiàn)在國(guó)際上通常采用哈迪-溫伯格檢驗(yàn)和孟德?tīng)栠z傳規(guī)律檢測(cè)無(wú)效等位基因;利用重復(fù)基因?qū)嶒?yàn)來(lái)檢測(cè)等位基因丟失現(xiàn)象[31-32]。

分子生物學(xué)調(diào)查方法不但可以提供較精確、可信性較強(qiáng)的大熊貓個(gè)體鑒定、區(qū)別方法,也能提供大熊貓的性別、遺產(chǎn)多樣性、種群間基因交流、擴(kuò)散格局等其他信息,對(duì)野生大熊貓保護(hù)和棲息地的規(guī)劃有著至關(guān)重要的作用[26]。但其調(diào)查成本較高、樣品處理要求高等缺點(diǎn)仍沒(méi)有得到進(jìn)一步的改善。國(guó)內(nèi)已有許多文獻(xiàn)描述如何在糞便中提取DNA[33-34],但提取過(guò)程相對(duì)于普通保護(hù)區(qū)/監(jiān)測(cè)站點(diǎn)仍是一個(gè)難題。在現(xiàn)有的技術(shù)方法、人員配置以及經(jīng)費(fèi)支持條件下,監(jiān)測(cè)站只能對(duì)糞便進(jìn)行簡(jiǎn)單預(yù)處理,初步提取DNA,等待送往專(zhuān)業(yè)的科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行下一步的工作。這個(gè)過(guò)程對(duì)最終的分析結(jié)果是否有影響值得討論。如何簡(jiǎn)化DNA提取操作以及如何減少調(diào)查過(guò)程中的開(kāi)銷(xiāo)是解決分子生物學(xué)調(diào)查法推廣的關(guān)鍵。另外,分子生物學(xué)調(diào)查法對(duì)糞便質(zhì)量要求較高,如何獲得新鮮的大熊貓糞便,也是利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行大熊貓種群數(shù)量調(diào)查需要解決的問(wèn)題。

2 總結(jié)與展望

大熊貓保護(hù)的相關(guān)政策和管理行動(dòng)減緩了數(shù)量下降,同時(shí)狩獵、棲息地破壞等行為幾乎消失,野生大熊貓種群和棲息地均得到了有效保護(hù),野生大熊貓的未來(lái)光明并充滿希望[35]。王朗自然保護(hù)區(qū)的首次調(diào)查揭開(kāi)了大熊貓種群數(shù)量調(diào)查的帷幕,經(jīng)過(guò)數(shù)十年積累,大熊貓種群數(shù)量調(diào)查取得巨大進(jìn)步;調(diào)查范圍由最初的自然保護(hù)區(qū)演變?yōu)槿珖?guó)范圍;調(diào)查目的由單一種群數(shù)量和分布情況演變?yōu)橐吧笮茇埛N群數(shù)量、分布現(xiàn)狀、棲息地狀況、野生大熊貓種群及棲息地受保護(hù)狀況、野生大熊貓棲息地受干擾或威脅狀況、圈養(yǎng)大熊貓種群狀況、野生大熊貓分布區(qū)經(jīng)濟(jì)狀況、大熊貓保護(hù)管理狀況與成效七大方面內(nèi)容綜合調(diào)查;調(diào)查方法由直接觀測(cè)過(guò)渡到間接識(shí)別,由擾動(dòng)較大到非損傷,由主觀判斷到客觀分析,由單一方法判別個(gè)體發(fā)展為多種技術(shù)手段綜合分析鑒定個(gè)體;調(diào)查工具也逐步采用3S(GPS、GIS、RS)技術(shù)等國(guó)際最前沿的方法。我國(guó)大熊貓種群數(shù)量調(diào)查體系初步形成。在此,我們根據(jù)各種調(diào)查方法發(fā)展中存在的問(wèn)題和目前野生大熊貓種群調(diào)查發(fā)展需求,提出3種未來(lái)可能利用的大熊貓種群調(diào)查方法。

2.1 分子生物學(xué)調(diào)查法

經(jīng)過(guò)20余年的沉淀后,分子生物學(xué)調(diào)查法可以提供較精確、可信性較強(qiáng)的種群數(shù)量,新的遺傳工具同樣揭示了種群結(jié)構(gòu)、量化大熊貓擴(kuò)散格局,已經(jīng)成為目前比較值得信任的調(diào)查方法之一,預(yù)計(jì)在今后較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)將會(huì)作為大熊貓種群數(shù)量調(diào)查的主要方法。大熊貓基因組測(cè)序的發(fā)布為基因標(biāo)記的研發(fā)提供便利,在將來(lái)使用SNP類(lèi)型進(jìn)行標(biāo)記可能會(huì)比微衛(wèi)星標(biāo)記更加容易。糞便中提取出成千上萬(wàn)SNP將進(jìn)一步轉(zhuǎn)變大熊貓的生態(tài)學(xué)、進(jìn)化學(xué)和保護(hù)學(xué)的研究[22]。

2.2 紅外相機(jī)技術(shù)

紅外相機(jī)陷阱技術(shù)是指通過(guò)自動(dòng)相機(jī)系統(tǒng)來(lái)獲取野生動(dòng)物圖像數(shù)據(jù)(如照片和視頻),這些圖像數(shù)據(jù)可以用來(lái)分析野生動(dòng)物的物種組成、分布、種群數(shù)量、行為和生境利用等基礎(chǔ)信息[36]。國(guó)外使用紅外相機(jī)技術(shù)開(kāi)展野生動(dòng)物調(diào)查研究已有較長(zhǎng)歷史,在20世紀(jì)90年代逐步發(fā)展成熟;我國(guó)使用紅外相機(jī)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究的工作起步較晚[37],在國(guó)內(nèi),研究者利用紅外相機(jī)記錄野生動(dòng)物的活動(dòng)模式,探測(cè)野生動(dòng)物的多樣性,或者記錄特定的野生動(dòng)物,如東北虎、大熊貓、雪豹及華南虎等[38]。相對(duì)于傳統(tǒng)調(diào)查方法,紅外相機(jī)技術(shù)不但具有客觀性、非損傷性、監(jiān)測(cè)類(lèi)群全面等優(yōu)點(diǎn),它還可以提供更為豐富的信息(例如物種出現(xiàn)的具體時(shí)間、先后順序、社會(huì)結(jié)構(gòu)等)[37]。紅外相機(jī)裝置隱秘和能持續(xù)觀測(cè)等特點(diǎn)適合于觀測(cè)棲息地地形復(fù)雜、采用直接觀察難以執(zhí)行、活動(dòng)隱秘?cái)?shù)量稀少的動(dòng)物,而且紅外相機(jī)獲取的調(diào)查數(shù)據(jù)可在“標(biāo)記-重捕”模型(Mark-Recapture Model)的理論框架下,使用專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件估算此物種的種群大小和密度[36]。

紅外相機(jī)技術(shù)具有直觀監(jiān)測(cè)大熊貓遷移動(dòng)態(tài)、提供準(zhǔn)確影像資料、補(bǔ)充豐富監(jiān)測(cè)庫(kù)數(shù)據(jù)、觀測(cè)人為/自然干擾及伴生動(dòng)物、減輕巡護(hù)人員工作壓力等優(yōu)點(diǎn),在大熊貓行為研究、大熊貓保護(hù)中的應(yīng)用前景光明,但對(duì)于大熊貓種群數(shù)量調(diào)查而言還屬于一種相對(duì)新的技術(shù)[39]。究其原因,主要是大熊貓只有黑白兩色,無(wú)法根據(jù)體側(cè)斑紋模式進(jìn)行個(gè)體識(shí)別,僅能通過(guò)傷疤或臉部花紋等其它個(gè)體特征進(jìn)行初步識(shí)別。另外紅外相機(jī)技術(shù)需要在觀測(cè)物種主要通道上布設(shè)大量相機(jī)并定期進(jìn)行維護(hù),而且后期對(duì)數(shù)據(jù)的分析整理也需要專(zhuān)業(yè)人士,這對(duì)人力物力是一個(gè)極大的考驗(yàn)?，F(xiàn)已有部分保護(hù)區(qū)安裝大量紅外相機(jī)用于監(jiān)測(cè)、保護(hù)等目的,尚無(wú)涉及種群數(shù)量調(diào)查,因此,紅外相機(jī)技術(shù)應(yīng)用于野生大熊貓種群調(diào)查需要進(jìn)一步的探討與嘗試。

2.3 足跡鑒定法

足跡鑒定法通過(guò)收集區(qū)域內(nèi)目標(biāo)動(dòng)物足跡信息(包括足跡圖像、足跡位置、發(fā)現(xiàn)時(shí)間等),輸入基于JMP(SAS insitute)軟件上的特定插件,自動(dòng)提取足跡圖像上的幾何信息并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)合其他信息綜合區(qū)分不同個(gè)體,最終統(tǒng)計(jì)區(qū)域內(nèi)種群數(shù)量(圖3)[40- 44]。足跡鑒定法的主要分析過(guò)程為軟件自動(dòng)完成,不存在主觀干擾,國(guó)外已利用足跡法對(duì)多種動(dòng)物進(jìn)行個(gè)體識(shí)別或種群數(shù)量調(diào)查,例如老虎(Pantheratigris)和雪豹(Pantherauncia)[41]、黑犀牛(Dicerosbicornis)[42]、美洲獅(Pumaconcolor)[43]等,在我國(guó)也有對(duì)東北虎(Panthemtigrisaltaica)雪地足跡進(jìn)行性別鑒定及個(gè)體識(shí)別的研究[40]。WildTrack動(dòng)物保護(hù)組織與美國(guó)杜克大學(xué)已合作開(kāi)展大熊貓足跡識(shí)別相關(guān)插件的研究工作。

相對(duì)于傳統(tǒng)調(diào)查方法,足跡鑒定法優(yōu)勢(shì)不僅在于其客觀性、非損傷性,而且它具有很高的投入產(chǎn)出比[45]。足跡鑒定法主要設(shè)備為相機(jī)與電腦,將符合要求的足跡圖片導(dǎo)入程序即可完成鑒定工作,普通監(jiān)測(cè)人員即能勝任對(duì)目標(biāo)物種長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)。足跡鑒定法適用于一些夜間出沒(méi)或是難以直接觀察物種的數(shù)量調(diào)查,并且足跡鑒定法可以更直接監(jiān)測(cè)目標(biāo)物種的遷移路線,這在一定程度上彌補(bǔ)現(xiàn)有調(diào)查方法的不足。同時(shí)足跡鑒定法也不會(huì)受昂貴儀器或者時(shí)間問(wèn)題限制,因此可以提供比無(wú)線遙測(cè)技術(shù)和紅外相機(jī)監(jiān)測(cè)技術(shù)更真實(shí)的動(dòng)物活動(dòng)范圍[45]。

圖3 Sky K.Alibhai等在白犀足跡上做的標(biāo)記點(diǎn)及衍生點(diǎn) (a)白犀牛的左后腳(b)白犀牛的左后腳足跡,包含標(biāo)記點(diǎn)(○)以及衍生點(diǎn)(■)[45]Fig.3 The landmark points and derived points made by Sky K. Alibhai on White rhinofootprint(a) White rhino left hind foot. (b) White rhino lefthind footprint showing landmark points(○)and derived points(■)[45]

圖4 (a)雪作為基質(zhì)收集的足跡(圖片來(lái)源：熊貓國(guó)際官網(wǎng))(b)泥土作為基質(zhì)收集的足跡 Fig.4 (a) Collect footprints in the substrate of snow.(Picture comes from：Panda International)(b) Collect footprints in the substrate of soil

應(yīng)用足跡法的首要條件是調(diào)查區(qū)擁有適當(dāng)?shù)幕|(zhì),目標(biāo)種群足底結(jié)構(gòu)足夠復(fù)雜,這樣才會(huì)收集到足夠清晰、滿足分析要求的圖片。大熊貓行走習(xí)性和腳底特征使得大熊貓足跡可以輕易的同其他物種區(qū)分開(kāi)來(lái)(如圖4所示,雪地上、泥地上大熊貓的足跡均可以清晰的反映出趾墊的輪廓)[3]。泉眼附近泥塘和冬季有積雪覆蓋地面是較為理想的基質(zhì)。但泥塘分布的局限性和積雪作為基質(zhì)的不穩(wěn)定性(容易融化或者被繼續(xù)的降雪覆蓋等)對(duì)足跡質(zhì)量影響很大,因此需要收集大量的足跡圖片用于篩選、分析。足跡收集工作可與保護(hù)區(qū)的日常巡護(hù)工作、糞便收集工作同時(shí)開(kāi)展。同時(shí),大熊貓足跡識(shí)別相關(guān)插件正在研發(fā)中,需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行校準(zhǔn)與驗(yàn)證。

本文通過(guò)對(duì)幾種大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法進(jìn)行了較全面的對(duì)比分析(表2)。未來(lái)開(kāi)展大熊貓種群數(shù)量調(diào)查時(shí)應(yīng)綜合考慮這些方法的調(diào)查范圍、時(shí)間尺度、人員配置、資金投入等因素,針對(duì)不同情形選用不同方法,發(fā)揮各種調(diào)查方法的優(yōu)勢(shì),保證調(diào)查數(shù)據(jù)的可靠性。另外,對(duì)于有條件保護(hù)區(qū)選用的調(diào)查方法應(yīng)具有延續(xù)性,這樣歷次調(diào)查結(jié)果可以進(jìn)行橫向?qū)Ρ?反應(yīng)出的種群數(shù)量變化更具有說(shuō)服力,為有關(guān)部門(mén)及時(shí)調(diào)整大熊貓保護(hù)策略提供科學(xué)依據(jù)。

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Research progress on population investigation methods for wild giant panda

SHI Xuewei1,3, ZHANG Jindong2, OUYANG Zhiyun1,*

1StateKeyLaboratoryofUrbanandRegionalEcology,ResearchCenterforEco-environmentalScience,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China2CollegeofLifeSciences,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong637009,China3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

The giant panda (Ailuropodamelanoleuca) is endemic to China and is a flagship for wildlife protection. Changes in panda population numbers reflect population dynamics in real-time, and also provide direct information about panda distribution and habitat. Panda population numbers are a basic requirement for giant panda resource surveys, and ensure the effective implementation of conservation measures. This paper reviews the progress of panda population survey methods, including the Direct Counting Method, the Mathematical Model, Distance-Bamboo Stem Fragments Method, and the Molecular Biology Method. In addition, we discuss new methods, such as camera-trapping and the Footprint Identification Technique, used to investigate populations of wild pandas in recent years. This paper reviews possible problems with traditional methods, and examines the prospects for the application of new methods in the future. Suggestions and prospects are proposed for future research into wild populations of giant pandas.

the giant panda; population investigation method; distance-bamboo stem fragments method; molecular biology method; infrared camera-trapping; footprint identification technique

國(guó)家林業(yè)局大熊貓國(guó)際資金項(xiàng)目(CM1417)

2015- 10- 29;

2016- 04- 25

10.5846/stxb201510292185

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zyouyang@rcees.ac.cn

史雪威,張晉東,歐陽(yáng)志云.野生大熊貓種群數(shù)量調(diào)查方法研究進(jìn)展.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(23):7528- 7537.Shi X W, Zhang J D, Ouyang Z Y.Research progress on population investigation methods for wild giant panda.Acta Ecologica Sinica,2016,36(23):7528- 7537.