醬香型白酒酒糟中耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌的篩選

陳　劍，蔣英麗，程　偉，高　鴻，羅愛(ài)民(.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院食品工程系，四川成都60000；.四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川古藺646500)

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醬香型白酒酒糟中耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌的篩選

陳劍1，蔣英麗2，程偉2，高鴻1，羅愛(ài)民1
(1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院食品工程系，四川成都610000；2.四川郎酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川古藺646500)

摘要：選取郎酒廠堆積后的酒糟，從中分離純種細(xì)菌。再以麩皮為培養(yǎng)基進(jìn)行純種發(fā)酵，通過(guò)改變麩皮的酸度及培養(yǎng)溫度，以感官評(píng)定和酯化力為標(biāo)準(zhǔn)，從中篩選出耐酸耐高溫且產(chǎn)酯香好的細(xì)菌ZP-3和ZP-28。以期通過(guò)添加該細(xì)菌強(qiáng)化曲到酒糟中，對(duì)改善酒糟的堆積時(shí)間和堆積效果有重要意義。

關(guān)鍵詞：酒糟；麩曲；細(xì)菌；酯香味；白酒

醬香型白酒屬大曲酒，主要以高粱為原料，酒質(zhì)具有醬香突出、幽雅細(xì)膩、柔和綿長(zhǎng)、酒體醇厚、入杯香氣持久、空杯留香久等風(fēng)格特點(diǎn)[1]，其最顯著特點(diǎn)就是空杯留香。但其生產(chǎn)工藝周期長(zhǎng)、糧耗多、產(chǎn)量低、資金周轉(zhuǎn)慢、成本高。為了減少環(huán)境對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，縮短發(fā)酵周期及降低成本，因此采用純種微生物制麩曲成為科研工作的努力方向[2]。

蒸酒后的酒糟在入池發(fā)酵前都要經(jīng)過(guò)一個(gè)堆積的過(guò)程，微生物大量生長(zhǎng)繁殖。酒糟的堆積是生成醬香型白酒的香味成分或香味前體的過(guò)程[3]，對(duì)酒質(zhì)的影響很大。與其他類(lèi)型的白酒相比較，醬香型白酒的釀造周期較長(zhǎng)，為8次發(fā)酵、7次取酒，以高粱為原料，經(jīng)數(shù)次加曲、堆積、發(fā)酵、蒸酒，隨著輪次的增加，酒糟的酸度也是隨著增加的，所以篩選耐酸性細(xì)菌投入生產(chǎn)有利于微生物的生長(zhǎng)發(fā)酵。

目前釀酒相關(guān)行業(yè)的科研人員對(duì)產(chǎn)酯的研究集中在霉菌[4-6]和酵母菌[7-8]，如黃丹等[4]從濃香型大曲中篩選出1株高產(chǎn)酯的黃曲霉，胡沂淮等[5]從洋河大曲中篩選出1株高酯化力紫紅曲霉菌株，原輕工業(yè)部發(fā)酵工業(yè)研究所分離的1312、1342、1343高產(chǎn)酯酵母菌，牛廣杰[8]從中高溫大曲中篩選出的BQC-1Y高產(chǎn)酯酵母等。關(guān)于大曲中產(chǎn)香細(xì)菌有一些基礎(chǔ)工作研究，如劉陽(yáng)等[9]從中高溫大曲中篩選出高產(chǎn)酯10#細(xì)菌，然而有關(guān)酒糟中微生物的研究較少，實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)良產(chǎn)香耐酸耐溫菌株也很少。本課題通過(guò)篩選出產(chǎn)香耐酸耐高溫的菌株，以酯化力為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選。利用純種培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，再重新加入酒糟中使用，以期可用于改變酒糟中的菌落結(jié)構(gòu)，從而可改善酒糟堆積時(shí)間或堆積效果，有利于改善酒質(zhì)，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酒。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

樣品：郎酒廠的堆積成熟酒糟。

試劑：本試驗(yàn)中應(yīng)用的生化試劑均為分析純及以上級(jí)別，溶液由蒸餾水配制。

儀器設(shè)備：JA1203分析天平，立式壓力蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，電熱干燥培養(yǎng)箱，真空干燥器，恒溫振蕩器，電熱鼓風(fēng)干燥箱，高速粉碎機(jī)，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，蒸餾裝置，pHs-3c酸度計(jì)，78HW-1恒溫磁力攪拌器等。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，麩皮培養(yǎng)基。

1.2分析方法

水分測(cè)定：采用常壓烘干法。

酸度、氨基態(tài)氮測(cè)定：采用電位滴定法[10-12]。

酯化力測(cè)定：參照QB/T 4257—2011。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌種的分離純化

細(xì)菌的分離純化用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。先將酒糟制備成菌懸液，隨后進(jìn)行濃度梯度稀釋?zhuān)?.1 mL的菌懸液涂布于平板上，于37℃下倒置培養(yǎng)1 d。通過(guò)平板劃線法將長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，將純化后的菌種移入斜面保藏，備用。

1.3.2產(chǎn)酯香菌株篩選試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)中操作，從斜面上挑取1環(huán)菌種接入LB液體培養(yǎng)基，進(jìn)行菌種的活化富集，于37℃下振蕩培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)結(jié)束后，按照3％接種量接種到三角瓶麩曲，在36～37℃下培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間，每天至少搖動(dòng)2次三角瓶，使麩曲松散，有利于菌種的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵。培養(yǎng)結(jié)束后，先進(jìn)行感官評(píng)定[13]，隨后于40℃干燥箱中通風(fēng)干燥，粉碎保存?zhèn)溆?，用于理化指?biāo)的測(cè)定。

麩皮培養(yǎng)基以麩皮為主，加入20％稻殼。稻殼先經(jīng)過(guò)蒸煮去除雜味，攤晾冷卻干燥后與麩皮進(jìn)行加水拌和，加水量70％。麩皮和稻殼拌和均勻后進(jìn)行常壓蒸料1 h，隨后進(jìn)行三角瓶的分裝，0.1 MPa壓力滅菌30 min。

1.3.3耐高溫產(chǎn)香菌株篩選試驗(yàn)

麩皮培養(yǎng)基的制作方法同1.3.2，只改變?nèi)瞧葵熐呐囵B(yǎng)條件，將培養(yǎng)溫度提高。在醬香型白酒生產(chǎn)中，高溫堆積階段溫度可達(dá)到50℃左右[14-16]，所以本試驗(yàn)選擇在49～50℃下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，放入干燥箱于40℃通風(fēng)干燥，經(jīng)粉碎保存?zhèn)溆?，用于理化指?biāo)的測(cè)定，從中篩選出耐高溫的細(xì)菌。

1.3.4耐酸耐高溫產(chǎn)香菌株篩選試驗(yàn)

麩曲的培養(yǎng)方法同1.3.3，但改變麩皮培養(yǎng)基的酸度，用乳酸[17-18]調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸度為0.4 mmolH/10 g干重、0.5 mmolH/10 g干重、0.6 mmolH/10 g干重。在49～50℃下培養(yǎng)72 h，40℃烘干備用，測(cè)其理化性質(zhì)，從中篩選耐酸耐高溫的細(xì)菌。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種的分離篩選結(jié)果

利用平板稀釋涂布法和平板劃線法，經(jīng)反復(fù)分離純化，得到22株菌株，多數(shù)呈現(xiàn)白色菌落，部分為黃色菌落和紅色菌落，單菌落于4℃斜面保存。經(jīng)顯微鑒定，這22株菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，其中多數(shù)為桿菌，少部分為球菌。

圖1　ZP-3(左)和ZP-27(右)鏡檢圖片

2.2產(chǎn)酯香菌株的篩選結(jié)果

對(duì)篩選出來(lái)的22株菌株進(jìn)行麩曲培養(yǎng)，每株菌株做3個(gè)平行樣，其中ZP-13菌株生長(zhǎng)發(fā)酵不良，糧糟味濃，故舍棄。根據(jù)感官評(píng)定的結(jié)果，篩選出產(chǎn)酯香味的菌株，測(cè)定其麩曲的酯化力，每項(xiàng)理化指標(biāo)做3個(gè)重復(fù)的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　常溫麩曲的感官和理化指標(biāo)

酯化力測(cè)定結(jié)果表明，在常溫培養(yǎng)下，ZP-8、ZP-2、ZP-17等菌株接種的麩曲酯化力較高，表明這些菌株產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，對(duì)麩曲的呈香呈味有一定的影響。在感官評(píng)價(jià)中ZP-2、ZP-17、ZP-36等菌株的產(chǎn)酯香較好，ZP-8、ZP-11、ZP-47等菌株的產(chǎn)氨味濃。氨味的存在雖對(duì)香味的評(píng)定有一定的影響，但酯化力的測(cè)定結(jié)果與感官評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，可以從感官評(píng)價(jià)結(jié)果選出產(chǎn)酯香的強(qiáng)弱來(lái)判斷酯化力的變化。進(jìn)而從這些菌株中篩選出耐高溫耐酸的產(chǎn)香菌株。

2.3耐高溫菌株的篩選結(jié)果

醬香型白酒的堆積為高溫堆積，溫度約為50℃[14]，篩選在此溫度下生長(zhǎng)良好的菌株。根據(jù)36～37℃麩曲培養(yǎng)結(jié)果，選擇表1中的菌株，調(diào)整麩曲的培養(yǎng)溫度為49～50℃。根據(jù)感官評(píng)定的結(jié)果，結(jié)合麩曲的成團(tuán)現(xiàn)象，可判定出菌株生長(zhǎng)狀況。如麩曲培養(yǎng)結(jié)果松散，糧糟味較濃，表明菌種生長(zhǎng)較差，發(fā)酵不良，即在該溫度下不適宜其生長(zhǎng)。篩選生長(zhǎng)良好的菌株，進(jìn)行酯化力的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　麩曲的感官和理化指標(biāo)

由表2可知，ZP-11、ZP-34、ZP-5等菌株酯化力較強(qiáng)，產(chǎn)酯香較好，ZP-17、ZP-18、ZP-35等菌株的酯化力較低，在感官評(píng)定時(shí)其產(chǎn)酯香較差。與常溫麩曲測(cè)定結(jié)果對(duì)比，多數(shù)菌株酯化力有所下降，表明在此條件下產(chǎn)酶較弱或酶活力不高。酯化酶受溫度影響較大，有研究表明與真菌相比較，一般細(xì)菌的酯化酶作用溫度較高[19]，溫度對(duì)于菌株產(chǎn)酶能力的影響不同[20]，不同菌株對(duì)于溫度的敏感性不同。

2.4耐酸耐高溫菌株的篩選結(jié)果

根據(jù)上一步測(cè)定結(jié)果及麩曲發(fā)酵生長(zhǎng)情況，從中篩選出10株耐高溫菌株，分別為ZP-2、ZP-3、ZP-5、ZP-7、ZP-11、ZP-22、ZP-27、ZP-28、ZP-34、ZP-47，進(jìn)行下一步耐酸性試驗(yàn)。先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，調(diào)節(jié)麩曲酸度分別0.3mmolH/10g干重、0.5mmolH/10g干重、0.7mmolH/10g干重、0.9 mmolH/10 g干重、1.1 mmolH/10 g干重、1.3 mmolH/10 g干重、1.5 mmolH/10 g干重、1.7 mmolH/10 g干重、1.9 mmolH/10 g干重、2.1 mmolH/10 g干重，選擇2株菌株ZP-2和Y5進(jìn)行接種培養(yǎng)，在49～50℃下培養(yǎng)72 h。酸度為0.7～2.1 mmolH/10 g干重時(shí)，麩曲松散，糧糟味很濃，表明在酸度大于0.7 mmolH/10 g干重的情況下，菌株生長(zhǎng)不良。因此將篩選出的10株耐高溫細(xì)菌分別接種到0.4 mmolH/10 g干重、0.5 mmolH/10 g干重、0.6 mmolH/10 g干重3個(gè)酸度麩皮培養(yǎng)基中，用于測(cè)定不同菌種的耐酸性，最終篩選出耐酸且產(chǎn)香好的細(xì)菌。

2.4.1麩皮酸度為0.4 mmolH/10 g干重的測(cè)定結(jié)果

用乳酸調(diào)節(jié)麩皮培養(yǎng)基的酸度為0.4 mmolH/10 g干重，經(jīng)分裝滅菌后接種，以49～50℃培養(yǎng)，其中ZP-7的麩曲松散，糧糟味較濃，為發(fā)酵不完全，表明該菌株不適宜在該條件下生長(zhǎng)，為不耐酸菌株。其他9株菌株發(fā)酵良好，表明可耐酸，篩選出進(jìn)行酯化力的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　麩曲的感官和理化指標(biāo)

由表3可知，在該培養(yǎng)條件下，ZP-3、ZP-34、ZP-22、ZP-2等菌種，麩曲的酯化力較高，其產(chǎn)酯香較好。ZP-5、ZP-27等酯化力較差，感官評(píng)定結(jié)果表明，產(chǎn)酯香較差。與未添加乳酸的麩曲培養(yǎng)結(jié)果相比，不同菌株酯化力變化不同，如ZP-3、ZP-22、ZP-34等菌株酯化力增加，ZP-5、ZP-27等菌株酯化力降低。劉陽(yáng)[9]的研究結(jié)果表明，酯化酶在不同pH值下其活性差別較大，不同來(lái)源的酯化酶其最適pH值差別也較大。因此在不同環(huán)境下不同菌株的酯化力不同，其變化規(guī)律不同。

2.4.2麩皮酸度為0.5 mmolH/10 g干重的測(cè)定結(jié)果

用乳酸調(diào)節(jié)麩皮培養(yǎng)基的酸度為0.5 mmolH/10 g干重，經(jīng)分裝滅菌后接種，以49～50℃培養(yǎng)，其中ZP-5、ZP-7、ZP-22和ZP-47的麩曲松散，糧糟味較濃，為發(fā)酵不完全，表明這些菌株不適宜在該條件下生長(zhǎng)，為不耐酸菌株。其他菌株生長(zhǎng)良好，酯化力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　麩曲的感官和理化指標(biāo)

酯化力測(cè)定結(jié)果表明，ZP-28、ZP-27、ZP-3的酯化力較強(qiáng)。但麩曲培養(yǎng)結(jié)果表明，ZP-27菌株生長(zhǎng)發(fā)酵較慢，在72 h終止發(fā)酵時(shí)，麩曲顏色較淺，成團(tuán)性較差。與麩皮酸度是0.4 mmolH/10 g干重的培養(yǎng)結(jié)果相比較，其中ZP-28、ZP-27菌株的酯化力增加，ZP-3菌株酯化力下降，ZP-2、ZP-34菌株酯化力下降較多。

2.4.3麩皮酸度為0.6 mmolH/10 g干重的測(cè)定結(jié)果

當(dāng)麩皮的酸度調(diào)節(jié)為0.6 mmolH/10 g干重時(shí)，6株菌株的麩曲發(fā)酵結(jié)果均不良，糧糟味較濃，表明這些菌種無(wú)法在該酸度條件下生長(zhǎng)。

耐酸性試驗(yàn)結(jié)果表明，從酒糟中篩選出的細(xì)菌，最高可在酸度為0.5 mmolH/10 g干重條件下生長(zhǎng)，其中ZP-3、ZP-28菌株培養(yǎng)的麩曲感官評(píng)定和理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果好，可篩選后進(jìn)行下一步試驗(yàn)研究，即投入釀酒的生產(chǎn)試驗(yàn)。

3　結(jié)論

酒糟的堆積是生成醬香型白酒的香味前體或香味成分的過(guò)程，對(duì)酒質(zhì)的影響很大。醬香型白酒的堆積為高溫堆積，溫度可達(dá)到50℃左右[15]，所以從酒糟中分離出耐高溫耐酸產(chǎn)香好的細(xì)菌，經(jīng)純種發(fā)酵，擴(kuò)大培養(yǎng)制作成強(qiáng)化曲，投入醬香型白酒的生產(chǎn)，通過(guò)改變菌落結(jié)構(gòu)，可獲得較好的效果，有利于改善酒質(zhì)，對(duì)釀造高質(zhì)的醬香型白酒具有重要意義。本課題目的在于篩選耐酸耐熱產(chǎn)酯香細(xì)菌，目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，已從酒糟中篩選出ZP-3、ZP-28菌株，其中ZP-28菌株酯化力較強(qiáng)，為28.362 U。關(guān)于生產(chǎn)實(shí)踐階段，還需要進(jìn)一步的研究探討。

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Screening of Acid-tolerant and Ester-aroma-producing Bacteria Strains From Jiangxiang Distiller’s Grains

CHEN Jian1,JIANG Yingli2,CHENG Wei2,GAO Hong1and LUOAimin1
(1.College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610000;2.Sichuan Langjiu Group Co.Ltd.,Gulin,Sichuan 646500,China)

Abstract:In this study,pure-species bacteria was isolated from distiller’s grains after the stacking in Langjiu Distillery.Then pure-species fermentation was done with bran as the culture mediums,and heat-tolerant,acid-tolerant and ester-aroma-producing strains (ZP-3 and ZP-28) were screened out through the change of bran acidity and culture temperature with sensory evaluation score and esterifying power as the judging indexes.The addition of the intensified starter of ZP-3 and ZP-28 in distiller’s grains could evidently improve the accumulation time and the accumulation effects of distiller’s grains.

Key words:distiller’s grains;bran starter;bacteria;ester aroma;Baijiu

通訊作者：羅愛(ài)民，E-mail：luoam@scu.edu.cn。

作者簡(jiǎn)介：陳劍（1992-），女，河南人，在讀碩士，食品科學(xué)，E-mail：heartchenjian@sina.com。

收稿日期：2015-10-27

基金項(xiàng)目：四川省科技廳基金項(xiàng)目(2015ZR0181)。

中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.3；TS261.1；TQ925.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）02-0061-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015413

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2015-12-30；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151230.0908.002.html。