綿羊脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(A-FABP)的變異研究

徐蕾，閆偉，胡江，劉秀，李少斌，王繼卿，羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅省牛羊基因

改良工程實驗室，甘肅 蘭州　730070)

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綿羊脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(A-FABP)的變異研究

徐蕾，閆偉，胡江，劉秀，李少斌，王繼卿，羅玉柱

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅省牛羊基因

改良工程實驗室，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 明確綿羊A-FABP(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)基因的變異和單倍型特征.【方法】 基于Ensemble數(shù)據(jù)庫中綿羊A-FABP基因全序列，對7個綿羊品種共20個樣本的A-FABP基因全序列進行測序分析.【結(jié)果】 PCR擴增獲得綿羊A-FABP基因全長6474 bp,A、T、G、C 4種堿基的比例分別為31.48%、33.02%、17.21%和18.29%,A+T平均含量為64.50%，G+C平均含量為35.50%；共發(fā)現(xiàn)48處單堿基變異位點和2處微衛(wèi)星位點M1((TG)n)和M2((TA)n)，單一變異位點、2核苷酸變異位點和3核苷酸變異位點比例分別為28.85%、40.4%和0.02%；共發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4種變異類型，其占變異位點總數(shù)的比例分別為45.83%、31.25%、2.08%及20.83%；共發(fā)現(xiàn)19種單倍型，單倍型多樣度為0.995.【結(jié)論】 A-FABP基因19個單倍型序列的NJ樹分化為2個聚類簇，表明A-FABP基因單倍型最初由2個主要單倍型衍化形成.

關(guān)鍵詞：綿羊；A-FABP基因；變異

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)屬于脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein family，F(xiàn)ABPs)家族.FABPs家族包括至少9種蛋白，該家族蛋白在細胞脂肪酸代謝及轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用[1].在哺乳動物中,A-FABP蛋白主要在脂肪細胞中表達[2-3]，參與甘油三酯形成，調(diào)控脂肪沉積[4].

人A-FABP基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，A-FABP基因變異與人糖尿病、心血管動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)[5-7].A-FABP基因是影響家畜脂肪沉積的主要候選基因之一，家畜A-FABP基因變異會影響相關(guān)經(jīng)濟性狀.研究表明，牛A-FABP基因參與脂肪蓄積過程[8]，A-FABP基因變異影響大理石紋、肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成[9-12].雞A-FABP基因第一外顯子C>T突變影響生長性狀[13]，第三外顯子A>G突變影響脂肪酸連接親和性及脂肪沉積[14].豬A-FABP基因與數(shù)量性狀位點(QTL)FAT1連鎖，A-FABP基因變異影響脂肪沉積[15].Yan等[16]發(fā)現(xiàn)綿羊A-FABP基因變異豐富，共發(fā)現(xiàn)14種潛在單倍型.Smith等[17]研究表明，綿羊A-FABP基因變異與羊絨抵抗腐爛能力有關(guān).

目前，綿羊A-FABP基因變異研究僅限于單個綿羊品種的部分基因區(qū)域，而針對中國多個綿羊品種的A-FABP全基因變異篩查研究少有報道.本研究選擇中國7個綿羊品種的20只個體，利用PCR和測序技術(shù)對A-FABP基因全序列進行變異分析，為綿羊A-FABP基因進化研究和開發(fā)綿羊A-FABP基因分子標記提供理論依據(jù).

1材料與方法

1.1綿羊血樣來源及采集

本研究選取7個綿羊品種的20個樣本，樣本來源和數(shù)量分別為‘中國美利奴羊’4只(CM)，‘多浪羊’2只(DL)，‘塔什庫爾干羊’3只(TS)，‘藏綿羊’2只(TB)，‘甘肅高山細毛羊’4只(GA)，‘哈薩克羊’3只(KA)和‘青海細毛羊’2只(QF).綿羊頸靜脈采血，血樣滴到FTA卡上干燥保存.

1.2綿羊基因組DNA提取，全序列擴增、純化及序列測定

綿羊血樣基因組DNA提取采用NaOH兩步法[18].根據(jù)Ensemble數(shù)據(jù)庫中公布的綿羊A-FABP基因序列(序列號：NM-001114667)，應(yīng)用Primer5.0軟件在線設(shè)計5對引物擴增覆蓋A-FABP基因全序列,引物序列見表1.引物由寶生物(大連)工程有限公司合成.

PCR采用50 μL的反應(yīng)體系，DNA模板源自FTA卡(1個1.2 mm的小圓盤)，上下游引物各1.5 μL，5×Prime STAR GXL Buffer 10 μL(大連，寶生物)，dNTP Mixture 4 μL(大連，寶生物)，PrimeSTAR GXL DNA酶1 μL(大連，寶生物)，ddH2O 29 μL.PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)，PCR產(chǎn)物4 ℃保存.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物.PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒純化回收(大連，寶生物)，純化產(chǎn)物送往北京六合華大基因公司測序.

表1　引物序列

1.3數(shù)據(jù)分析

人工拼接PCR擴增片段組成綿羊A-FABP基因全序列，以Ensemble數(shù)據(jù)庫中公布的綿羊A-FABP基因序列為參考序列，應(yīng)用DNAMAN軟件進行序列比對，分析變異位點位置、數(shù)目和類型.應(yīng)用DnaSP v.5.10軟件評估A-FABP基因核苷酸和單倍型多樣性，計算多態(tài)位點、核苷酸總變異位點及簡約信息位點.應(yīng)用分子進化遺傳分析軟件MEGA5.0中的NJ算法構(gòu)建綿羊A-FABP基因全序列的分子進化樹.

2結(jié)果與分析

2.1綿羊A-FABP基因擴增序列長度和堿基組成

中國7個綿羊品種的20只個體的A-FABP基因擴增序列長度為6474bp，堿基 A、T、G、C含量分別為31.48%、33.02%、17.21%和18.29%，A+T平均含量為64.50%，G+C平均含量為35.50%，說明中國綿羊A-FABP基因全序列富含A和T堿基.

2.2綿羊A-FABP基因變異位點

研究結(jié)果表明A-FABP基因所有變異均存在于非編碼區(qū)和上下游側(cè)翼區(qū)域，而編碼區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)變異位點.研究共發(fā)現(xiàn)48處單堿基變異位點(表2)，變異位點總數(shù)約占擴增序列堿基數(shù)的0.74%.變異位點中單一多態(tài)位點15處，約占變異位點總數(shù)的31.25%.簡約多態(tài)位點22處，約占變異位點總數(shù)的45.83%，其中兩堿基變異位點21處，三堿基變異位點1處.插入/缺失位點11處，約占變異位點總數(shù)的22.92%.單一變異位點分布在591、598、599、1572、1591、1854、2180、2765、2810、2816、2919、3193、4773、5431和5469位點.兩堿基變異位點分布在336、1103、1774、1776、1806、1912、1913、1983、2119、2918、2921、3081、3212、3393、3425、3952、3961、4305、4905、4963和5687位點，三堿基變異位點分布在1376位點.插入/缺失位點分布在324、325、1377、1441、2767、2789、2827、3949、4257、5414和5426位點.微衛(wèi)星位點M1和M2的重復(fù)單元為簡單的二核苷酸重復(fù)，其結(jié)構(gòu)分別為 (TG)n和 (TA)n(表2).

2.3綿羊A-FABP基因變異類型和單倍型

A-FABP基因變異存在轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失4種變異類型，其分別占變異位點總數(shù)的45.83%、31.25%、2.08%及20.83%.研究測定綿羊A-FABP基因20條序列，共鑒定19種單倍型(圖1)，單倍型序列間多樣度為0.995，核苷酸多樣度為0.125%，單倍型序列平均核苷酸差異數(shù)為8.042.19種單倍型在綿羊群體中的分布見圖1，其中‘中國美利奴羊’群體存在4種單倍型(H1、H2、H3和H4)，‘多浪羊’群體存在2種單倍型(H5和H6)，‘塔什庫爾干羊’群體存在3種單倍型(H7、H8和H9)，‘藏綿羊’群體存在2種單倍型(H10、H11)，‘甘肅高山細毛羊’群體存在4種單倍型(H12、H13、H14和H15)，‘哈薩克羊’群體存在2種單倍型和H17)，‘青海細毛羊’群體存在2種單倍型(H18和H19).

圖1　綿羊A-FABP基因19個單倍型序列的NJ樹Fig.1　NJ tree constructed by 19 haplotypic sequences of ovine A-FABP gene

2.4綿羊A-FABP基因全序列分子系統(tǒng)樹

構(gòu)建綿羊A-FABP基因19條單倍型序列的分子系統(tǒng)樹(圖1)，結(jié)果表明系統(tǒng)樹分化為2個大的聚類簇(A和B).A類包括11條序列，18個多態(tài)位點，核苷酸多樣度為0.850%，單倍型序列平均核苷酸差異數(shù)為5.491；B類包括8條序列，25個多態(tài)位點，核苷酸多樣度為0.140%，各單倍型序列平均核苷酸差異數(shù)為9.071.A類包括‘多浪羊’‘塔什庫爾干羊’‘藏綿羊’‘甘肅高山細毛羊’‘哈薩克羊’和‘青海細毛羊’6個群體；B類包括‘甘肅高山細毛羊’‘中國美利奴羊’‘塔什庫爾干羊’和‘哈薩克羊’5個群體.構(gòu)建綿羊A-FABP基因與其他物種A-FABP基因的系統(tǒng)進化樹(序列號分別為：牛NM_174314；豬EF061482.1；人HGNC:3559；狗E2R974；貓HGNC:3559；雞NP_989621)(圖2)，結(jié)果表明鄰接系統(tǒng)樹呈現(xiàn)明顯的兩支分化.綿羊A-FABP基因與牛A-FABP基因聚在一起，說明牛A-FABP基因序列與綿羊A-FABP基因序列具有很高的同源性.

圖2　綿羊他其它物種A-FABP基因序列的NJ樹Fig.2　NJ tree constructed by the sequence of A-FABP gene from sheep and other species

3討論

3.1綿羊A-FABP基因核苷酸

目前為止，綿羊A-FABP基因變異研究國內(nèi)外均有報道，例如Yan等[16]對新西蘭8個綿羊品種的A-FABP基因局部區(qū)域進行研究，共發(fā)現(xiàn)9條變異序列和8處變異位點.Xu等[19]研究發(fā)現(xiàn)中國3個地方品種綿羊A-FABP基因內(nèi)含子1存在A>G突變.Smith等[17]發(fā)現(xiàn)澳州美利奴羊A-FABP基因變異與羊毛性狀質(zhì)量有關(guān).本研究初步對中國部分綿羊品種A-FABP基因全序列進行變異篩查，發(fā)現(xiàn)所有變異均存在于內(nèi)含子區(qū)域及上下游側(cè)翼區(qū)域.Yan等[16]發(fā)現(xiàn)新西蘭8個綿羊品種中A-FABP基因第3外顯子均存在A>G變異，該變異導(dǎo)致106位氨基酸改變(Lys(AAG)>Arg(AGG))，而本研究中國綿羊品種中均未檢測出此變異，該變異是否存在于中國綿羊群體中還需增加樣本及綿羊品種數(shù)量進一步驗證.

本研究發(fā)現(xiàn)綿羊A-FABP基因變異存在轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入4種類型，轉(zhuǎn)換和顛換比例分別為45.83%和31.25%，轉(zhuǎn)換頻率高于顛換頻率，這一結(jié)果與線粒體基因組DNA進化特點一致.哺乳動物線粒體基因組DNA轉(zhuǎn)換的頻率通常高于顛換頻率，因為CpG二核苷酸上的甲基化胞嘧啶殘基最易發(fā)生突變，可自發(fā)脫去氨基而形成胸腺嘧啶.

中國綿羊群體A-FABP基因變異較豐富，共發(fā)現(xiàn)48處變異位點，這一結(jié)果與豬A-FABP基因研究結(jié)果一致.Ojeda等[20]對10個豬種的23個個體進行A-FABP基因全序列測序，共鑒定出134個變異位點，說明豬A-FABP基因變異極豐富，其變異率遠遠大于綿羊等其他家畜，而深入研究A-FABP基因變異如何產(chǎn)生將會利于解釋家畜A-FABP基因高變異率的原因.

3.2綿羊A-FABP基因系統(tǒng)發(fā)育與同源性

研究對7個綿羊品種共20個樣本的A-FABP基因全序列進行測序，共鑒定19種單倍型.各綿羊品種間沒有共享單倍型，且品種內(nèi)單倍型較豐富.各單倍型為各綿羊品種獨有，且頻數(shù)只出現(xiàn)1次，但單倍型H11在‘藏綿羊’群體2個個體中同時出現(xiàn)，這說明單倍型H11可能為‘藏綿羊’A-FABP基因優(yōu)勢單倍型，但需進一步驗證.綿羊A-FABP基因19個單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析中，樹型呈明顯的兩支分化，這表明中國綿羊A-FABP基因最初可能是由2個主要單倍型突變分化成兩大類單倍型群.系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果還表明綿羊A-FABP基因與牛A-FABP基因具有較高的同源性，說明綿羊和牛A-FABP基因最早可能來自于它們分歧以前的共同祖先的原始序列.研究發(fā)現(xiàn)單倍型H10與綿羊參考序列同源，且單倍型H10為藏綿羊獨有，這說明藏綿羊A-FABP基因序列和已知綿羊A-FABP基因參考序列具有較高的同源性.

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(責任編輯胡文忠)

Variations on ovine adipocyte fatty-acid binding protein (A-FABP) gene

XU Lei,YAN Wei,HU Jiang,LIU Xiu,LI Shao-bin,WANG Ji-qing,LUO Yu-zhu

(College of Animal Science and Technology,Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology, Gansu Engineering Laboratory of Genetic Improvement in Runminants,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The paper is aimed at revealing genetic variation and the characteristics of haplotype in sheep.【Method】 Based on the complete sequence of ovine A-FABP gene in Ensemble database,the A-FABP gene was sequenced and analyzed in 20 samples collected from 7 breeds.【Result】 The sequence (6 474 bp) of the A-FABP gene was obtained by the PCR process.The average percent of four bases (A,T,G and C) was 31.48%,33.02%,17.21% and 18.29%,respectively,the average content of A+T and G+C is 64.50% and 35.50% ,respectively.Forty eight variation sites and two microsatellite loci for M1((TG)n)and M2((TA)n)were found,the percentage of single variation site,two variation sites and three variation sites was 28.85%,40.4% and 0.02%,respectively.4 variation types (transition,transversion,insertion and deletion) were observed,and their ratio was 45.83%,31.25%,2.08% and 20.83%,respectively.19 haplotypes were found and the haplotype diversity was 0.995.【Conclusion】 The NJ tree constructed by nineteen haplotypes developed two main clusters,which indicated that 19 haplotypes initially derived from two main haplotypes.

Key words：sheep；A-FABP gene；variation

通信作者：羅玉柱，男，教授，博導(dǎo)，研究方向為生物技術(shù)與動物育種.E-mail:luoyz@gsau.edu.cn

基金項目：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1421)；甘肅省創(chuàng)新研究群體計劃(1210RJIA005)；國家科技支撐計劃(2012BAD13B05)；國家國際科技合作專項(2011DFG33310)； 甘肅省國際科技合作專項(1304WCGA178 ).

收稿日期：2015-03-04；修回日期：2015-04-03

中圖分類號：S 826

文獻標志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0029-06

第一作者：徐蕾(1987-)，女，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖.E-mail:18893704730@163.com