腦紅蛋白在成年牦牛小腸腸腺中的定量分析

陳斌，劉霞，曹亮，劉應(yīng)祥，楊陽(yáng)，杜曉華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 酒泉　735000；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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腦紅蛋白在成年牦牛小腸腸腺中的定量分析

陳斌1，劉霞1，曹亮2，劉應(yīng)祥1，楊陽(yáng)3，杜曉華3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 酒泉735000；

3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】檢測(cè)腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)在成年牦牛小腸腸腺中的表達(dá)量.【方法】 在免疫組織化學(xué)SP法染色基礎(chǔ)上，運(yùn)用IPP圖像分析軟件測(cè)定牦牛小腸腸腺中染色區(qū)域的平均積分光密度值，再結(jié)合SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.【結(jié)果】 NGB在成年牦牛小腸腸腺中均有表達(dá).在十二指腸腸腺、十二指腸腺(黏膜下腺)中測(cè)定的MIOD值分別為0.004 6、0.040 9，在空腸腸腺中測(cè)定的MIOD值為0.001 8，在回腸腸腺中測(cè)定的MIOD值為0.001 6.十二指腸表達(dá)量最多，空腸、回腸順次遞減；十二指腸腺(黏膜下腺)顯著(0.01

關(guān)鍵詞：腦紅蛋白；牦牛；腸腺；平均積分光密度

2000年，德國(guó)科學(xué)家Burmester等[1]在《Nature》上首次報(bào)道，在人和小鼠腦內(nèi)存在一類(lèi)新的攜氧球蛋白，對(duì)氧具有很高的親和力，由于該蛋白最先在大腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)，故稱(chēng)之為腦紅蛋白(neuroglobin，NGB).此后，科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn) NGB存在于哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、爬蟲(chóng)類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物體內(nèi)[2-4]，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、分布及功能等方面進(jìn)行了研究.2013年，曹亮等[5]在成年牦牛消化系統(tǒng)的內(nèi)分泌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了NGB陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)，為NGB在哺乳動(dòng)物消化系統(tǒng)中生理生化功能的研究提供了新的思路與途徑.小腸是哺乳動(dòng)物消化道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要器官，其內(nèi)分布的腸腺具有分泌腸液的能力，大量的腸液可以稀釋消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其滲透壓下降，有利于營(yíng)養(yǎng)吸收[6].常用的適用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的圖像分析軟件有ImageJ、IPP、CMIAS圖像分析系統(tǒng)及CIAS-1000等多種軟件，其中IPP軟件以其強(qiáng)大的測(cè)定分析功能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、工業(yè)、軍事等領(lǐng)域[7-8].本研究在曹亮等[5]的研究基礎(chǔ)上采用免疫組化SP法和平均積分光密度分析法(mean integrated optical density，MIOD)對(duì)NGB在成年牦牛小腸腸腺中的分布進(jìn)行了定量研究，研究結(jié)果為掌握NGB在成年牦牛消化腺細(xì)胞中的分布特點(diǎn)及進(jìn)一步探討NGB的生理生化功能提供了詳細(xì)的形態(tài)學(xué)資料，也為牦牛高原低氧環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)理研究提供相關(guān)的數(shù)據(jù)參考.

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

成年牦牛小腸組織樣本來(lái)自于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室，采集自甘肅省甘南自治州，多聚甲醛固定保存.

1.2組織切片制作流程

首先制作小腸各段組織石蠟切片，然后進(jìn)行免疫組化SP法染色[9-10]，同時(shí)設(shè)立HE染色組和陰性對(duì)照組.組織切片制作主要包括固定、包埋、切片、染色等步驟，鏡檢合格后拍照并對(duì)圖片進(jìn)行相關(guān)測(cè)定與分析.

1.3圖像測(cè)定

IPP圖像分析軟件的眾多參數(shù)中，積分光密度(integrated optical density，IOD)是指測(cè)定的顯微圖像結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)各個(gè)像素點(diǎn)的光密度之和，可反映所測(cè)結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化.IOD與特定物質(zhì)的質(zhì)量成正比，數(shù)值反映了特定物質(zhì)的相對(duì)含量[11].在計(jì)算特定組織區(qū)域光密度值時(shí)需先測(cè)定該特定區(qū)域的面積，然后再做除法，得出更為準(zhǔn)確的MIOD(MIOD=IOD/面積值).

運(yùn)用NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)對(duì)染色切片進(jìn)行拍照，IPP圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定，具體步驟如下：1)測(cè)定特定區(qū)域面積：隨機(jī)選取需要測(cè)定的區(qū)域，轉(zhuǎn)換為Object后測(cè)定該區(qū)域的面積；2)測(cè)定特定區(qū)域IOD：在原選定的區(qū)域上進(jìn)行光密度值校正，選擇測(cè)定項(xiàng)目，設(shè)置分色選擇參數(shù)，計(jì)算出IOD值.將測(cè)定出的兩個(gè)數(shù)值導(dǎo)入Excel 2010軟件計(jì)算出各染色區(qū)域的MIOD值，陰性對(duì)照的MIOD值測(cè)定方式同上，其測(cè)定結(jié)果均為0.

1.4數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

牦牛小腸各腸段組織切片見(jiàn)圖1-4.經(jīng)顯微鏡鏡檢確認(rèn)，牦牛小腸中腸腺均為管狀腺，分為兩種，一種位于十二指腸、空腸、回腸固有層中的腸腺，另一種位于十二指腸黏膜下層中的十二指腸腺，屬于黏膜下腺[12].運(yùn)用IPP軟件對(duì)各腸段免疫組化SP法染色圖片進(jìn)行NGB定量檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，以十二指腸腺(黏膜下腺)表達(dá)量最高，回腸腸腺表達(dá)量最低.在十二指腸腺(黏膜下腺)中測(cè)定的MIOD值為(0.040 9±0.010 141)；在十二指腸腸腺中測(cè)定的MIOD值為(0.004 6±0.000 305)；在空腸腸腺中測(cè)定的MIOD值為(0.001 8±0.000 487)；在回腸腸腺中測(cè)定的MIOD值為(0.001 6±0.000 403).

a：免疫組化染色；b：陰性對(duì)照；c：HE染色；標(biāo)尺示20 μm.圖1　NGB在成年牦牛十二指腸腸腺中的表達(dá)Fig.1　The expression of NGB in duodenal intestinal glands in adult yak

a：免疫組化染色；b：陰性對(duì)照；c：HE染色；標(biāo)尺示20 μm.圖2　NGB在成年牦牛十二指腸腺中的表達(dá)Fig.2　The expression of NGB in duodenal glands in adult yak

a：免疫組化染色；b：陰性對(duì)照；c：HE染色；標(biāo)尺示20 μm.圖3　NGB在成年牦?？漳c腸腺中的表達(dá)Fig.3　The expression of NGB in jejunum intestinal glands in adult yak

a：免疫組化染色；b：陰性對(duì)照；c：HE染色；標(biāo)尺示20 μm.圖4　NGB在成年牦牛回腸腸腺中的表達(dá)Fig.4　The expression of NGB in ileum intestinal glands in adult yak

腸段十二指腸腸腺空腸腸腺回腸腸腺十二指腸腺(黏膜下腺)10.00460.00150.00190.044920.00430.00140.00200.052430.00490.00260.00190.045640.00500.00210.00120.026550.00440.00180.00120.0351Mean±SD0.0046±0.0003050.0018±0.0004870.0016±0.0004030.0409±0.010141

經(jīng)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖5所示.NGB在十二指腸腺(黏膜下腺)中的表達(dá)量極顯著高于陰性對(duì)照(P<0.01)，認(rèn)定NGB在十二指腸腺(黏膜下腺)中有陽(yáng)性表達(dá)；NGB在十二指腸腸腺、空腸腸腺、回腸腸腺中的表達(dá)量都顯著地高于陰性對(duì)照(P<0.05)，認(rèn)定NGB在十二指腸腸腺、空腸腸腺、回腸腸腺中均有陽(yáng)性表達(dá).

*:陽(yáng)性與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；**:陽(yáng)性與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01).圖5　NGB在成年牦牛不同腸腺中的表達(dá)Fig.5　The expression of NGB in different intestinal glands in adult yak

NGB在成年牦牛不同腸段的腸腺中表達(dá)量的比較如圖6所示.在不同腸段內(nèi)，NGB在同種腺體中的表達(dá)量不同，十二指腸腸腺的MIOD值為0.004 6，空腸腸腺的MIOD值為0.001 8，回腸腸腺的MIOD值為0.001 6.經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析和多重比較，結(jié)果表明，NGB在十二指腸的表達(dá)量顯著高于其在回腸和空腸的表達(dá)量(P<0.05)，空腸又高于回腸，但差異不顯著(P>0.05).在十二指腸內(nèi)，十二指腸腺(黏膜下腺)的MIOD值為0.040 9，十二指腸腸腺的MIOD值為0.004 6，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)定數(shù)值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，NGB在十二指腸腺(黏膜下腺)表達(dá)量顯著高于其在十二指腸腸腺表達(dá)量(P<0.05).

標(biāo)有相同字母表示無(wú)顯著差異，標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05).圖6　NGB在成年牦牛不同腸段的腸腺中表達(dá)量的比較Fig.6　Expressive quantity of NGB in different intestinal glands in adult yak

3討論與結(jié)論

NGB的發(fā)現(xiàn)為了解機(jī)體氧代謝機(jī)制提供了新的線索和依據(jù)，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn).Reuss等[13]利用原位雜交方法在嚙齒類(lèi)動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的某些組織細(xì)胞中檢測(cè)到了NGB的表達(dá).秦豪杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)NGB在人腺垂體、胰島、腎上腺等一些內(nèi)分泌細(xì)胞中有陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明NGB對(duì)內(nèi)分泌細(xì)胞功能的維持有一定作用.本研究顯示，NGB在成年牦牛十二指腸腸腺、空腸、回腸腸腺以及十二指腸腺(黏膜下腺)的內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)均有陽(yáng)性表達(dá)，而在其他細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)，這一分布特點(diǎn)與曹亮等[5]的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明NGB在內(nèi)分泌組織生理功能的正常發(fā)揮中也起著重要的作用.

付成英等[15]研究發(fā)現(xiàn)在人胎兒小腸固有層結(jié)締組織中有散在的內(nèi)分泌細(xì)胞，其分布數(shù)量以十二指腸最多，空腸、回腸順次遞減.本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛不同腸段內(nèi)NGB的表達(dá)量亦不同，其在十二指腸腸腺的表達(dá)量顯著高于其在空腸和回腸的表達(dá)量，這說(shuō)明NGB在不同內(nèi)分泌細(xì)胞中的表達(dá)情況具有特異性，提示這與十二指腸、空腸、回腸的消化能力逐漸減弱，需氧量逐漸變少有關(guān).

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NGB在牦牛同一腸段內(nèi)不同腺體中的表達(dá)量不同，在十二指腸腺(黏膜下腺)的表達(dá)量顯著高于其在十二指腸腸腺的表達(dá)量，提示這可能與內(nèi)分泌細(xì)胞在小腸的腺體中分布不均以及與NGB的生理生化功能相關(guān)，甚至可能與十二指腸腺(黏膜下腺)作為一種重要的分泌腺在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的功能強(qiáng)于十二指腸腸腺有聯(lián)系，但是這種聯(lián)系是否與牦牛對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)還需要進(jìn)一步證實(shí).綜上所述，NGB在哺乳動(dòng)物消化組織、器官中的首次發(fā)現(xiàn)為NGB在消化器官生理生化功能的研究提供了新的思路[16].

NGB自發(fā)現(xiàn)即成為了研究熱點(diǎn)，很多學(xué)者在其分布和功能等方面進(jìn)行了較深入的研究[17-18]，但是現(xiàn)有的文獻(xiàn)中對(duì)于NGB在人和動(dòng)物體內(nèi)的分布表達(dá)與其生理作用機(jī)制聯(lián)系起來(lái)的報(bào)道極為少見(jiàn).因此有關(guān)NGB作用機(jī)制的研究將會(huì)是未來(lái)相關(guān)研究的方向和重點(diǎn).

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

Quantitative analysis of neuroglobinin intestinal glands in adult yak

CHEN Bin1,LIU Xia1,CAO Liang2,LIU Ying-xiang1,YANG Yang3,DU Xiao-hua3

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Jiuquan Vocational and Technical College,Jiuquan 735000,China；3.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The objective of this study is to detect the expressive quantity of neuroglobin (NGB) in intestinal glands of adult yak.【Method】 Based on SP method of immunohistochemistry dyeing,the mean integral optical density of yak intestinal glands，staining region was determined by IPP image analysis software,the data were analyzed with SPSS statistical software.【Result】 NGB was expressed in all intestinal glands of adult yak.Values of MIOD detected in intestinal glands of duodenum and duodenal gland were 0.004 6 and 0.040 9.Values of MIOD detected in the intestinal glands of jejunum andileum were 0.001 8 and 0.001 6.The expressive quantity of NGB in duodenal glands was the most and ileum was the least.The most expression was in duodenum,jejunum was at a median value,ileum was the least.Expression in duodenal gland was significantly higher than in intestinal glands of duodenum.【Conclusion】 The NGB was distributed in all intestinal glands of adult yak,duodenal gland obtaining the most abundant.It suggested that NGB in tissues and cells of adult yaks，intestinal glands plays an important role in oxygen utilization and functional activities.

Key words：neuroglobin;yak ;the small intestine;mean integrated optical density

通信作者：杜曉華，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物解剖學(xué)與組織學(xué)研究.E-mail:duxh@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2013)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生SRTP重點(diǎn)項(xiàng)目(20140811).

收稿日期：2015-03-06；修回日期：2015-04-20

中圖分類(lèi)號(hào)：S 852.16

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)01-0024-05

第一作者：陳斌(1993-)，男，本科生，研究方向?yàn)閯?dòng)物解剖學(xué)與組織學(xué).E-mail:501200399@qq.com