飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響

唐德富，劉醒醒，劉國華，郝生燕

(1.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室,北京　100081；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；

3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響

唐德富1,2，劉醒醒2，劉國華1，郝生燕3

(1.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室,北京100081；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；

3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 研究飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響.【方法】選用240只21 d‘科寶’肉公雞，隨機(jī)分為3組，分別飼喂粗蛋白質(zhì)水平為16%(16%CP組),18%(18%CP組)和20%(20%CP組)的3種飼糧，每組設(shè)8個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，42 d測定腸道PepT1和bo,+AT mRNA含量.【結(jié)果】 16%CP組平均日增質(zhì)量、氮利用率和代謝能值均顯著低于其他2組(P<0.05)，而料肉比顯著高于其他2組(P<0.05).PepT1 mRNA表達(dá)以空腸最高，十二指腸次之，回腸最低，且空腸顯著高于十二指腸和回腸(P<0.05)；bo,+AT mRNA表達(dá)以回腸最高，十二指腸次之，空腸最低，而回腸顯著高于十二指腸和空腸(P<0.05)，十二指腸顯著高于空腸(P<0.05).隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加，飼糧干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率和消化能值均有提高，但未達(dá)到顯著性水平(P>0.05).肉仔雞小腸各腸段PepT1 mRNA和bo，+AT mRNA的表達(dá)均隨飼糧粗蛋白質(zhì)水平的提高而有不同程度的改善，16%CP組PepT1 mRNA在十二指腸和空腸的表達(dá)顯著低于20%CP組(P<0.05)，其在空腸的表達(dá)顯著低于18%CP組(P<0.05).20%CP組bo,+AT mRNA在十二指腸和空腸的表達(dá)顯著高于16%CP組(P<0.05).【結(jié)論】適宜的飼料粗蛋白質(zhì)水平有利于PepT1和bo,+AT mRNA的表達(dá).

關(guān)鍵詞：粗蛋白質(zhì)水平；肉仔雞；PepT1；bo,+AT

蛋白質(zhì)作為動物生長的必需營養(yǎng)物質(zhì)之一，密切參與組織器官的生長發(fā)育，飼糧中蛋白質(zhì)不足或過量均會影響肉仔雞養(yǎng)分消化利用和生產(chǎn)性能[1].家禽采食的蛋白質(zhì)，必須被胃腸道消化酶分解成小分子物質(zhì)如氨基酸、小肽后方可被腸道吸收進(jìn)入體內(nèi)，而這類小分子物質(zhì)的吸收是通過腸道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)載體的作用得以實現(xiàn)[2-4].PepT1是一種重要的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在動物組織中的分布具有差異性，主要在腸道中表達(dá)[5-6].PepT1具有質(zhì)子依賴性特征，其表達(dá)量受多種因素的調(diào)控，如腸道中氨基酸的種類、動物生產(chǎn)水平、飼料營養(yǎng)水平和環(huán)境因素等[7-9].氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)被稱為“系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)”，每類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由多個轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同的轉(zhuǎn)運(yùn)載體組成,腸道對于堿性氨基酸的吸收主要是通過腸道上皮細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[10-11].腸道中存在的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括y+、b0,+、y+L.系統(tǒng)b0,+主要在腸道和腎小管上皮細(xì)胞頂端表達(dá),主要功能為從腸腔面吸收堿性氨基酸和胱氨酸,轉(zhuǎn)出中性氨基酸,其重鏈為rBAT，輕鏈為SLC7A9[4].Elizabeth等[8]報道肉仔雞飼糧中使用高品質(zhì)蛋白飼料豆粕顯著上調(diào)PepT1和bo,+AT mRNA的表達(dá)豐度.因此，本試驗旨在研究飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響，以期為完善蛋白質(zhì)營養(yǎng)理論體系提供一定的參考.

1材料與方法

1.1動物試驗

1.1.1試驗動物與試驗設(shè)計選用240只體質(zhì)量接近一致，健康的21 d‘科寶’肉公雞供試，隨機(jī)分為3組(組的安排考慮位置效應(yīng))，飼喂粗蛋白質(zhì)水平分別為16%、18%和20%的飼糧，每組設(shè)8個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞.試驗期為21 d，1～21 d所有試雞采食商業(yè)飼料.試驗飼糧為玉米-豆粕型，營養(yǎng)水平參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，NY/T 33-2004》推薦的營養(yǎng)水平配制，計算配方時，飼料原料中粗蛋白質(zhì)、鈣和磷的含量用實測值，其他指標(biāo)參考中國飼料數(shù)據(jù)庫2012年飼料成分及營養(yǎng)價值表.飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1.

1.1.2飼養(yǎng)管理及免疫試雞采用3層疊籠飼養(yǎng)，免疫程序參照商業(yè)公司推薦的方案，機(jī)械通風(fēng)，24 h連續(xù)光照，自由飲水，自由采食.及時清理糞便，定期消毒，以保證雞舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生良好.準(zhǔn)確記錄處理組各重復(fù)日采食量和死淘情況.

1.1.3樣品采集于38～41 d進(jìn)行代謝試驗，每天收集糞尿樣(剔除雞毛、飼料、皮屑等污染物)稱質(zhì)量后混勻，然后取20% 的鮮糞尿樣，按100 g鮮糞尿加入10%鹽酸10 mL充分混勻后置于樣品袋中，4 ℃冷藏，最后將4 d內(nèi)所取樣品充分混合，置于65 ℃烘箱烘干，空氣中回潮24 h，稱質(zhì)量.

于42 d末以重復(fù)為單位，采用放血法屠宰全部試雞，迅速分離回腸，收集回腸內(nèi)容物，-20 ℃保存，經(jīng)冷凍干燥處理后制樣，待測.并從每個重復(fù)挑選2只接近平均體質(zhì)量的雞分離腸道，沿縱向剖開，用4 ℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)沖洗，再用吸水紙吸干.分別從十二指腸U狀彎曲，空腸和回腸中部處向下取3 cm 腸段，放入1.5 mL 離心管中，置液氮速凍,-70 ℃冷凍保存.

表1　飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

預(yù)混料向每千克飼料提供Mn 110 mg，Cu 10 mg，I 0.5 mg，VA 8 000 IU，VD 31 600 IU，VE 5 IU，VK 30.5 mg，泛酸2.5 mg，VB63.0 mg，生物素0.1 mg，葉酸0.25 mg，VB120.04 mg，煙酸20 mg.

1.1.4測定指標(biāo)與分析分別在試驗開始及結(jié)束時以重復(fù)為單位，稱量試雞體質(zhì)量，統(tǒng)計平均日增質(zhì)量、平均日采食量、料質(zhì)量比和死淘率.待測樣品中常規(guī)營養(yǎng)養(yǎng)分的測定參考《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[12]的方法進(jìn)行，二氧化鈦含量的測定參照Short等[13]報道方法.

1.2小腸PepT1和bo,+AT mRNA的相對定量

1.2.1樣品總RNA的提取將冷凍的腸道組織樣加液氮研磨成粉，移入微量離心管中，每100 mg樣品中加入1 mL TRIzol試劑，充分混勻，按試劑盒說明用TRIzol一步法提取總RNA.用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，核酸蛋白濃度測定儀測定D260/280值及濃度.若RNA有明顯的28S和18S 2條帶，核酸蛋白濃度測定儀測定D260/280值均在1.8～2.0之間，表明RNA質(zhì)量好，備存用于反轉(zhuǎn)錄.

1.2.2反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL：2 μg RNA，1 μL oligo(dT)20，1 μL dNTP，加DEPC水至12 μL，混合物在65 ℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻，短暫離心后，加入4 μL 5×First Strand Buffer，1 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase Inhibitor，1 μL M-MLV，混合后于PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，獲得cDNA第1鏈.

1.2.3引物設(shè)計、合成和PCR條件從GenBank里搜索雞PepT1和bo,+AT mRNA 序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(引物參數(shù)見表2)，其中β-actin作為內(nèi)參基因.

PCR反應(yīng)體系參照王維民等[14]報道結(jié)果，即為25 μL：12.5 μL PCR Master Mix，上下游引物各0.8 μL，1 μL cDNA，10 μL ddH2O.反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表2)，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min.進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，同時以不加模板的體系作對照，以排除試劑污染和基因組DNA污染引起假陽性的可能.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

表2　PepT 1、bo,+AT和β-actin基因引物參數(shù)

1.3數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

2.1粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

本試驗中，僅有2只試雞死亡或淘汰，且均非處理效應(yīng)所致，所以表3中未列該項.由表3可以看出，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞平均日采食量無顯著影響(P>0.05).16%CP組平均日增質(zhì)量顯著低于其他2組(P<0.05)，而料肉比顯著高于其他2組(P<0.05).

表3　日糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

同列數(shù)據(jù)小寫字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.2粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞養(yǎng)分消化和利用的影響

由表4可見，隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平的增加，干物質(zhì)消化率、粗蛋白質(zhì)消化率和消化能均有提高，但未達(dá)到顯著性水平(P>0.05).16%CP組氮利用率和代謝能值顯著低于其他兩組(P<0.05).其他指標(biāo)各組間差異均不顯著(P>0.05).

表4　日糧粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞養(yǎng)分消化利用的影響

2.3粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞小腸各腸段PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響

2.3.1RNA質(zhì)量的檢測由圖1可見，從肉仔雞小腸中提取的總RNA在1%瓊脂糖凝膠電泳中28S RNA、18S RNA條帶明亮可見，而5S RNA條帶灰暗，說明樣品總RNA完整，降解量較少.另取少量RNA稀釋，進(jìn)行紫外檢測，所有樣品的D260/280均在1.8～2.0之間，說明RNA的樣品滿足后續(xù)上機(jī)測定要求.

圖1　腸道總RNA提取鑒定結(jié)果Fig.1　The identification result of total RNA extracted from intestinal

2.3.2肉仔雞小腸各腸段PepT1和bo,+AT mRNA的表達(dá)差異待測基因與內(nèi)參基因光密度比值的大小可直接反映基因表達(dá)的豐度.由表5可以看出，PepT1與β-actin的光密度比值以空腸最高，十二指腸次之，回腸最低，且其值在空腸顯著高于十二指腸和回腸(P<0.05).bo,+AT與β-actin的光密度比值以回腸最高，十二指腸次之，空腸最低，其值在回腸顯著高于十二指腸和空腸(P<0.05)，且十二指腸顯著高于空腸(P<0.05).

2.3.3粗蛋白質(zhì)水平與PepT1和bo,+AT mRNA的表達(dá)由表6可見，隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平的提高，肉仔雞小腸各腸段PepT1與β-actin的光密度比值均有不同程度的增加，且16%CP組的十二指腸和空腸光密度比值顯著低于20%CP組(P<0.05)，其空腸比值顯著低于18%CP組(P<0.05).高蛋白水平改善了腸道bo,+AT mRNA的表達(dá)，即20%CP組的十二指腸和空腸bo,+AT與β-actin的光密度比值顯著高于16%CP組(P<0.05,表7).

表5　肉仔雞小腸各腸段PepT1 、bo,+AT與β-actin的光密度比值

同行肩標(biāo)小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

表6　粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞小腸各腸段PepT1與β-actin的光密度比值的影響

表7　粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞小腸各腸段bo,+AT與β-actin的光密度比值的影響

3討論與結(jié)論

3.1粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞生產(chǎn)性能和養(yǎng)分消化利用的影響

蛋白質(zhì)營養(yǎng)在動物營養(yǎng)中占有非常重要的地位，動物高效利用飼料蛋白質(zhì)一直是動物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點之一.家禽對飼糧粗蛋白質(zhì)的變化比較敏感，柏明娜等[15]報道，AA+肉仔雞后期飼糧蛋白質(zhì)水平從18%降低到16.5%，肉仔雞體增質(zhì)量顯著降低，該結(jié)果與本試驗結(jié)果相一致，說明肉仔雞飼糧粗蛋白質(zhì)的配制范圍較窄，提高飼糧配制的精確性十分有必要.本試驗中，處理組間飼糧氮利用率和代謝能值的顯著差異導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率的顯著變化，其根本原因在于飼糧能氮比的變異.在能氮比失衡的情況下,血液中轉(zhuǎn)氨酶活性、血脂、游離脂肪酸和酮體含量升高,造成機(jī)體代謝機(jī)能紊亂,養(yǎng)分利用率下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低[16-17].采食量與日糧組成及營養(yǎng)水平密切相關(guān),家禽的進(jìn)食量很大程度取決于能量和蛋白質(zhì)的需要量.早期研究發(fā)現(xiàn),隨著日糧粗蛋白質(zhì)水平增加,家禽的采食量下降[17].本試驗中肉仔雞采食量未出現(xiàn)顯著變化，其原因不明，可能是由于肉仔雞以滿足飽腹感為首要采食需要，不同于蛋雞、鴨子等其他家禽“以能為食”的理論.

3.2粗蛋白質(zhì)水平對肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)的影響

腸道是動物消化吸收養(yǎng)分的重要場所，腸上皮細(xì)胞作為腸道重要的功能結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，直接參與食物的消化、吸收及內(nèi)外分泌.腸上皮細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)豐度直接影響?zhàn)B分的吸收.小肽和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)具有組織特異性，且同一組織在不同發(fā)育階段表達(dá)豐度各不相同[6].PepT1和bo,+AT mRNA表達(dá)豐度越高，與之相聯(lián)系的氨基酸吸收較好.譚會澤等[4]報道結(jié)直腸bo,+AT的mRNA 表達(dá)豐度極顯著低于十二指腸、空腸和回腸,其在回腸表達(dá)豐度高于空腸、十二指腸,差異不顯著.Gilbert等[18]報道PepT1和bo,+AT分別在十二指腸和回腸的表達(dá)豐度最高.PepT1在肉仔雞出殼前后的組織表達(dá)譜差異較大，如孵化18日齡時在小腸上皮的表達(dá)以空腸最高，而出殼后3日齡以十二指腸最高[19].本試驗中，關(guān)于bo,+AT的mRNA 表達(dá)結(jié)果與譚會澤等[4]和Gilbert等[18]報道結(jié)果一致，但PepT1的表達(dá)豐度以空腸最高，可能與肉仔雞的日齡、日糧類型、營養(yǎng)水平、生理狀況等因素相關(guān)，也說明堿性氨基酸主要吸收部位在回腸，而小鈦主要在空腸.

Chen等[20]研究結(jié)果表明肉仔雞飼喂12%粗蛋白質(zhì)水平組飼糧腸道PepT1 mRNA的表達(dá)豐度顯著低于18%和24%處理組，且日齡和粗蛋白質(zhì)水平間有顯著的交互作用.本試驗中，隨著飼糧粗蛋白質(zhì)水平的提高，肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT的表達(dá)均有提高，部分結(jié)果與Chen等[20]報道一致.就其原因可能有2個方面：一方面飼糧蛋白質(zhì)水平的提高使得內(nèi)源消化蛋白質(zhì)的酶量相應(yīng)增加，促進(jìn)了腸道載體的表達(dá)[21-22]；另一方面蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)物氨基酸和肽同樣對載體的表達(dá)具有調(diào)控作用，如腸道中甘氨酸-谷氨酰胺二肽的增加可促進(jìn)PepT1 mRNA的表達(dá)和甘氨酸-肌氨酸二肽的吸收[22].

綜上所述，飼糧粗蛋白質(zhì)水平影響肉仔雞腸道PepT1和bo,+AT mRNA的表達(dá)，適宜的粗蛋白質(zhì)水平有助于基因的表達(dá).

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(責(zé)任編輯李辛)

Effect of crude protein level of diets on mRNA expression of PepT1 and bo,+AT at intestinal of broilers

TANG De-fu1,2,LIU Xing-xing2,LIU Guo-hua1,HAO Sheng-yan3

(1.Key Laboratory of Feed Biotechnology,The Ministry of Agriculture of the People′s Republic of China,Beijing 100081,China;2.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;3.Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 To assess the effect of dietary crude protein level on mRNA expression of intestinal PepT1 and bo,+AT of broilers.【Method】 240 male Cobb broilers were selected and assigned randomly into three groups,each with 8 repeats and 10 birds for per repeat,and were fed the three diets with the protein level of 16% (16%CP),18% (18%CP) and 20% (20%CP),respectively.【Result】 The average daily body weight gain,n utilization rate and metabolizable energy of 16% CP was higher than those of others (P<0.05),but the reverse case for Feed/Gain (P<0.05).There was the highest expression of PepT1 mRNA at jejunum,and the lowest at ileum,as well as jejunum was significantly higher than that at the duodenum and ileum (P<0.05).Bo,+AT mRNA expression was highest in the ileum,and lowest at jejunum,and ileum was significantly higher than that in the duodenum and jejunum(P<0.05),and duodenum was significantly higher than that of the jejunum (P<0.05).With increasing of dietary crude protein level,dry matter digestibility,crude protein digestibility and digestible energy of diets w ere increased as well,but did not reach to the significant level (P>0.05).The expression of PepT1 and bo,+AT mRNA were improved with increasing of dietary crude protein level.The expression of PepT1 mRNA at both duodenum and jejunum of 16%CP was significantly lower than those of 20%CP (P<0.05),and the jejunum of it was significantly lower than that of 18%CP (P<0.05).20%CP group had the higher expression of bo,+AT mRNA in the duodenum and jejunum than that of 16%CP (P<0.05).【Conclusion】 The results indicate that the expression of PepT1 and bo,+AT mRNA could be improved by suitable dietary crude protein level.

Key words：crude protein level;broiler;PepT1;bo,+AT

通信作者：劉國華，男，研究員，主要從事家禽營養(yǎng)研究.E-mail:liuguohua@caas.cn

基金項目：農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室開放課題.

收稿日期：2015-03-02；修回日期：2015-09-28

中圖分類號：S 831.92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)01-0001-06

第一作者：唐德富(1982-)，男，講師，主要從事動物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究.E-mail:tangdf@gsau.edu.cn