不同栽培條件下辣椒果實(shí)辣椒素含量的分析與QTL定位

王 寧 張正海 王立浩 張寶璽

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

王寧，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：andy2012win@163.com

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不同栽培條件下辣椒果實(shí)辣椒素含量的分析與QTL定位

王 寧 張正海 王立浩 張寶璽*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

王寧，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：andy2012win@163.com

摘 要：利用辣味辣椒Perennial（Capsicum annuum）和無辣味辣椒83-58種內(nèi)重組自交系群體構(gòu)建的辣椒種內(nèi)遺傳圖譜，以溫室和露地栽培條件下無辣味辣椒77013A與重組自交系群體各株系雜交F1果實(shí)的辣椒素和二氫辣椒素含量作為表型性狀進(jìn)行分析。結(jié)果表明，溫室和露地栽培條件下辣椒素和二氫辣椒素的含量和比值差異明顯。對露地和溫室栽培條件下辣椒果實(shí)辣椒素和二氫辣椒素含量、總和及其比值進(jìn)行了QTL定位，共獲得16個關(guān)于辣椒素和二氫辣椒素含量的QTL位點(diǎn)，分布在辣椒第2、4、12號染色體上，2號染色體上同時控制辣椒素、二氫辣椒素、二者比值和辣椒素總量的主效QTL位點(diǎn)cap2.1、dhp2.1、C/D2.1和（C+D）2.1，均在露地和溫室被檢測到，其LOD值大于5.0，貢獻(xiàn)率為20.2%～76.6%，側(cè)翼標(biāo)記均為BD76366和Pun1，12號染色體上調(diào)控辣椒素總量的微效QTL也在溫室和露地同時被檢測到，其他QTL位點(diǎn)未在兩種環(huán)境下同時定位到。

關(guān)鍵詞：辣味；辣椒素類物質(zhì)；環(huán)境；QTL

辣椒（Capsicum annuum）是茄科辣椒屬的一種重要蔬菜作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。辣椒因其獨(dú)特的辛辣刺激性而廣為人們喜愛（Govindarajan，1985；Perkins et al .，2002）。人們感覺到“辣味”，是辣椒中的辣椒素與人體神經(jīng)系統(tǒng)中的辣椒素受體（Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）結(jié)合，而使人產(chǎn)生的一種輕微痛覺刺激（Caterina et al.，1997）。辣椒中辣椒素類物質(zhì)主要存在于辣椒的胎座組織和隔膜中，其中以辣椒素（capsaicin，CAP）和二氫辣椒素（dihydrocapsaicin，DHP）為主，兩者含量達(dá)到了辣椒素總量的80%以上（Kozukue et al.，2005）。研究表明，控制辣椒辣味的單顯性基因Pun1位于2號染色體上，編碼?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase）（Lee et al.，2005；Lang et al.， 2006），Kim等（2001）找到了一個Pun1的候選基因SB2-66，在胎座中特異表達(dá)，編碼AT3。目前也發(fā)現(xiàn)了Pun1基因的3個無辣味突變位點(diǎn)pun11、pun12和pun13（Stewart et al.，2007；Stellari et al.，2010），并以此開發(fā)了特異的分子標(biāo)記（Wyatt et al.，2012）。

辣椒素的含量決定了辣味的強(qiáng)弱，表現(xiàn)為數(shù)量遺傳（Zewdie & Bosland，2000a，2000b；Ben-Chaim et al.，2006），辣椒素類物質(zhì)受環(huán)境條件的影響（Harvell & Bosland，1997；Gurung et al.，2011），Phimchan等（2012）的研究表明，干旱脅迫會影響不同辣度材料的辣椒素積累水平，彭瓊等（2015）認(rèn)為輕度干旱能顯著提高辣椒果實(shí)中辣椒素類物質(zhì)含量。對于辣椒素類物質(zhì)的QTL定位研究，在7號染色體上找到兩個QTL位點(diǎn)cap7.1和cap7.2（Blum et al.，2003；Paran et al.，2010），而后又在3、4、5、6、10和11號染色體上發(fā)現(xiàn)了辣椒素類物質(zhì)含量的QTL位點(diǎn)（Ben-Chaim et al.，2006；Yarnes et al.，2013），目前1、2、9、12 號染色體還未定位到和辣椒素類物質(zhì)含量相關(guān)的位點(diǎn)，而且關(guān)于不同環(huán)境下辣椒素和二氫辣椒素含量變化及相應(yīng)的QTL定位比較分析的研究還較少。

本試驗(yàn)利用以SNP標(biāo)記（KASPar分型技術(shù)）為主構(gòu)建的一年生辣椒種內(nèi)遺傳圖譜，以無辣味辣椒77013A與此種內(nèi)圖譜群體各株系雜交F1果實(shí)的辣椒素含量為表型性狀，對露地和溫室栽培環(huán)境下的辣椒素、二氫辣椒素含量、辣椒素總量和辣椒素/二氫辣椒素比值進(jìn)行了QTL定位，為辣椒辣味即辣椒素含量高低的遺傳控制研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試材及取樣

有辣味辣椒Perennial和無辣味辣椒83-58雜交種內(nèi)重組自交系F7群體（RILs），以及無辣味辣椒77013A均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組提供。作圖群體是Perennial×83-58以單粒傳的方式構(gòu)建的F7RILs群體，共113個株系（52個有辣味、61個無辣味）；性狀調(diào)查的群體以77013A為母本，分別以Perennial、83-58和RILs群體113個株系為父本，進(jìn)行人工雜交獲得115個雜交F1。

于2013年9月將RILs群體113個株系、83-58、Perennial和77013A各4株定植于本所廊坊基地日光溫室，苗期提取基因組DNA；2014年3月和4月分別將77013A、 83-58、Perennial和115個雜交F1定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口基地的露地和溫室，3次重復(fù)，每個重復(fù)8株。定植后用溫濕度記錄儀實(shí)時記錄環(huán)境溫濕度變化，每隔2 h記錄一次。

1.2辣椒素和二氫辣椒素的測定

果實(shí)青熟時（約授粉后60 d），采集77013A、83-58、Perennial和115個雜交F1正常青熟果實(shí)，摘除果柄、基部胎座和種子，65 ℃干燥24 h，用磨樣機(jī)打成粉末，取0.500 g粉末利用超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)測定辣椒素和二氫辣椒素含量。每個樣本3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)6個果實(shí)。UPLC由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心完成，采用優(yōu)化的提取方法，將稱好的0.500 g辣椒粉末加入甲醇+四氫呋喃（1 V∶1 V）混合溶液25 mL，封口后搖床振蕩30 min，然后置于37 ℃水浴條件使用超聲波提取10 min，靜置30 min后吸取上清液加入到上樣瓶中，進(jìn)行色譜分析。

1.3遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

辣椒種內(nèi)遺傳圖譜中以ES命名的400個SSR標(biāo)記由本所辣椒課題組開發(fā)，其余521個SSR、228個CAPS和2個SCAR標(biāo)記來自已報道的辣椒遺傳圖譜（Wu et al.，2009；Wyatt et al.，2012）。4個InDel標(biāo)記和27個CAPS標(biāo)記是本所辣椒課題組通過對試驗(yàn)雙親SlEF重測序?qū)Σ町愋蛄性O(shè)計所得。SNP（KASpar）標(biāo)記的序列由法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，試驗(yàn)方法參照LGC公司的方法進(jìn)行（http：//www.kbioscience.co.uk）。將親本和RILs群體中篩選到的多態(tài)性標(biāo)記數(shù)據(jù)導(dǎo)入Joinmap 4.0軟件（van Ooijen，2006）進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳連鎖圖。圖譜構(gòu)建的LOD≥ 3.0，步長為0.5，算法為regression mapping，去除無效標(biāo)記的閾值設(shè)為5.0，采用Kosambi函數(shù)（Kosambi，1943）計算遺傳距離。然后結(jié)合露地和溫室測定的辣椒素和二氫辣椒素含量數(shù)據(jù)，利用MapQTL 3.0軟件區(qū)間作圖法（Interval Mapping）進(jìn)行QTL定位，將LOD閾值定為Permutation Test檢驗(yàn)結(jié)果＞95%時的值來確定QTL存在。

表1　溫室與露地溫度和濕度比較

2　結(jié)果與分析

2.1溫室與露地的栽培環(huán)境差異

通過溫濕度記錄儀每2 h記錄一次溫室和露地的溫濕度數(shù)據(jù)（表1）。5～7月，露地的月平均溫度比溫室高1.01 ℃，月平均最低溫度比溫室低1.04℃，月平均最高溫度比溫室高3.52 ℃，從而使露地溫差比溫室大4.56 ℃。在環(huán)境濕度上，露地平均濕度為55.14%，溫室平均濕度為71.80%，溫室濕度比露地高16.66個百分點(diǎn)。

2.2不同栽培條件下辣椒素含量變化

77013A與Perennial、83-58、RILs群體的115個雜交F1中，露地77013A×Perennial辣椒素總量為3 490.50 mg·kg-1，溫室為4 419.72 mg·kg-1，溫室比露地高26.6%；而77013A×RILs的辣椒素總量在露地平均為272.42 mg·kg-1，溫室中平均為195.61 mg·kg-1，溫室比露地低28.2%（表2）。77013A與RILs群體各株系113個F1中，有52個單株同時合成辣椒素和二氫辣椒素（圖1，辣椒素和二氫辣椒素都為0的單株未列出），其中39個單株的辣椒素總量露地高于溫室，剩余13個單株則是溫室高于露地，露地整體的辣椒素總量高于溫室。

除77013A×Perennial的F1辣椒素含量溫室比露地高33.3%外；其余不論是辣椒素還是二氫辣椒素含量，露地條件下的測定值均高于溫室的測定值（表2）。而溫室中辣椒素與二氫辣椒素的比值則大于露地。綜上可以看出：露地在高溫且溫差較大、濕度較低的環(huán)境下，辣椒素和二氫辣椒素的積累量大多高于溫室。

表2　親本和RILs群體中辣椒素類物質(zhì)含量

圖1　有辣味的77013A×RILs F1群體在溫室和露地條件下辣椒素類物質(zhì)含量變化

2.3辣椒素含量的QTL定位

Perennial含辣椒素6 091.62 mg·kg-1，二氫辣椒素2 184.42 mg·kg-1，77013A兩物質(zhì)含量均為0。Perennial×77013A（辣味辣椒×無辣味辣椒）的F1辣椒素含量為2 513.61 mg·kg-1，二氫辣椒素為976.89 mg·kg-1，介于雙親Perennial與77013A之間，而83-58×77013（無辣味辣椒×無辣味辣椒）F1的辣椒素、二氫辣椒素含量均為0（表2）。可見辣椒素和二氫辣椒素含量的遺傳表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)。且77013A與RILs群體測交一代中，辣椒素和二氫辣椒素的含量呈連續(xù)分布，可以利用構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行QTL定位。

在RILs群體中共檢測到溫室和露地環(huán)境下有關(guān)辣椒素、二氫辣椒素、辣椒素總量及辣椒素/二氫辣椒素的16個QTL位點(diǎn)，位于第2、4、12號染色體上（圖2）。在溫室和露地共同檢測到的辣椒素QTL位點(diǎn)1個、二氫辣椒素QTL位點(diǎn)1個，辣椒素總量QTL位點(diǎn)2個，辣椒素/二氫辣椒素QTL位點(diǎn)1個（表3）。其中，除了辣椒素總量在12號染色體上露地和溫室定位到了一個共同微效位點(diǎn)外，其他各項的共同位點(diǎn)均為位于P2b連鎖群上的主效QTL，而其他微效QTL位點(diǎn)未在兩種環(huán)境下同時檢測到。溫室中，辣椒素、二氫辣椒素和辣椒素總量均在P2c連鎖群同一位置檢測到微效位點(diǎn)；在露地環(huán)境下，辣椒素和二氫辣椒素均在12號染色體上定位到同一減效微效位點(diǎn)，二氫辣椒素在P4a連鎖群上也檢測到微效位點(diǎn)（表3）。

圖2　辣椒素、二氫辣椒素、辣椒素總量及辣椒素/二氫辣椒素在RILs（83-58×Perennial）群體中的QTL定位G指溫室QTL位點(diǎn)；F指露地QTL位點(diǎn)。

表3　辣椒素和二氫辣椒素在RILs群體的QTL定位

辣椒素（CAP）：共檢測到4個QTL位點(diǎn)，其中2個為溫室和露地共同主效QTL位點(diǎn)，側(cè)翼標(biāo)記均為BD76366和Pun1，位于2號染色體上，均為加性效應(yīng)。同時在2號染色體另一區(qū)域，溫室檢測到一微效QTL位點(diǎn)，而露地未檢測到，側(cè)翼標(biāo)記為UN33215_371和UN23439_1194，貢獻(xiàn)率為8.0%，表現(xiàn)為增效位點(diǎn)。而在12號染色體上僅在露地條件下檢測到一微效QTL位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率11.0%，為減效位點(diǎn)，說明控制辣椒素含量的位點(diǎn)受環(huán)境調(diào)控。

二氫辣椒素（DHP）：共檢測到5個QTL位點(diǎn)，除了僅在露地條件下檢測到位于P4a連鎖群一微效QTL位點(diǎn)，其他位點(diǎn)位置均與辣椒素的QTL位點(diǎn)一致，只是貢獻(xiàn)率有所差異。該微效QTL位點(diǎn)側(cè)翼標(biāo)記為UN02951_367和UN30277_447，貢獻(xiàn)率為9.9%，表現(xiàn)為增效位點(diǎn)。

辣椒素總量（CAP+DHP）：露地和溫室分別在P2b和P12的相同位置檢測到主效和微效QTL位點(diǎn)，溫室還在P2c連鎖群檢測到微效QTL。

辣椒素/二氫辣椒素（CAP/ DHP）：溫室和露地均在2號染色體的BD76366和Pun1之間檢測到控制辣椒素/二氫辣椒素的主效QTL位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率分別為30.4%和76.6%，加性效應(yīng)，未在其他染色體上檢測到其他QTL位點(diǎn)。

3　結(jié)論與討論

分子遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位有助于辣椒的分子標(biāo)記輔助育種選擇，在以往的研究中，依靠RAPD、RFLP、SSR等標(biāo)記構(gòu)建的辣椒圖譜取得了很大進(jìn)展，但也存在圖譜密度不夠高、連鎖群較多的問題（劉峰 等，2012；段蒙蒙，2014）。本試驗(yàn)利用種內(nèi)F7重組自交系為作圖群體，以KASPar技術(shù)分型SNP標(biāo)記為主，結(jié)合SSR和CAPs標(biāo)記構(gòu)建的較高密度的遺傳圖譜，有利于進(jìn)行農(nóng)藝性狀的定位和輔助育種。

對于辣味有無的遺傳，通過辣味辣椒×無辣味辣椒（F1）辣椒素類物質(zhì)的含量測定，可以看出辣味遺傳為非質(zhì)量性狀，辣味強(qiáng)弱在分離群體中差異明顯，辣椒素類物質(zhì)含量受環(huán)境影響。Otha（1962）認(rèn)為高溫可以增加辣椒素類物質(zhì)積累。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：和溫室相比，露地表現(xiàn)為高溫低濕、溫差大，露地RILs測交群體的辣椒素類物質(zhì)的含量大多高于溫室，表明高溫且溫差較大、低濕環(huán)境更有利于辣椒素類物質(zhì)的積累；辣椒素/二氫辣椒素則為溫室高于露地，呈現(xiàn)相反的結(jié)果，說明環(huán)境條件對辣椒素和二氫辣椒素的影響是不同的。從露地和溫室二氫辣椒素的含量看，露地二氫辣椒素含量升高得快，使得辣椒素與二氫辣椒素比值降低，環(huán)境因素對二氫辣椒素的影響較大。本試驗(yàn)測交一代群體中，大部分單株辣椒素總量露地高于溫室，而少數(shù)則是露地低于溫室，是試驗(yàn)誤差還是環(huán)境敏感的遺傳位點(diǎn)調(diào)控使然，還有待進(jìn)一步探究。

本試驗(yàn)利用測交群體對辣椒素和二氫辣椒素含量進(jìn)行QTL定位，得到的16個QTL位點(diǎn)，分別位于第2、4、12號染色體上，其中G-cap2.1、F-cap2.1、G-dhp2.1、F-dhp2.1、G-（C+D）2.1、F-（C+D）2.1、G-C/D2.1和F-C/D2.1同時被定位在了2號染色體上相同區(qū)域，且均為主效QTL位點(diǎn)，側(cè)翼標(biāo)記為Pun1與BD76366，不同環(huán)境下的貢獻(xiàn)率有差別，且露地環(huán)境的貢獻(xiàn)率均超過了40%，高于溫室。QTL位點(diǎn)的重疊表明該位點(diǎn)同時調(diào)控辣椒素與二氫辣椒素的合成，也調(diào)控辣椒素與二氫辣椒素的比值及總量的大小。其他微效QTL位點(diǎn)中，G-cap2.2、G-dhp2.2和G-（C+D）2.2同時被定位在P2c連鎖群的UN33215_371和UN23439_1194之間，而露地環(huán)境下未被檢測到，表明該位點(diǎn)為溫室所特有的；而在12號染色體上同時獲得了露地調(diào)控辣椒素、二氫辣椒素和辣椒素總量的F-cap12.1、F-dhp12.1 和F-（C+D）12.1，溫室僅在辣椒素總量上定位到G-（C+D）12.1位點(diǎn)，P2c和P12兩處的微效位點(diǎn)可能為環(huán)境敏感的微效QTL。露地環(huán)境下還檢測到位于4號染色體UN02951_367和UN30277_447之間的F-dhp4.1位點(diǎn)，本試驗(yàn)沒有定位到關(guān)于辣椒素與二氫辣椒素比值的微效QTL位點(diǎn)。上述微效QTL位點(diǎn)調(diào)控了辣椒素和二氫辣椒素含量及辣椒素總量的變化，且在不同栽培環(huán)境下進(jìn)行調(diào)控的QTL位點(diǎn)有所差異，說明環(huán)境因子（溫度或濕度）通過影響某些QTL位點(diǎn)來調(diào)控兩物質(zhì)含量的變化，導(dǎo)致溫室與露地辣椒素類物質(zhì)含量及比值的差異。本試驗(yàn)利用種內(nèi)RILs群體作圖并進(jìn)行QTL定位，RILs群體遺傳背景較為相近，相比前人利用種間群體獲得的位點(diǎn)相對要少一些（Ben-Chaim et al.，2006；Yarnes et al.，2013）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了兩種環(huán)境條件下存在差異的QTL位點(diǎn)，為以后系統(tǒng)研究環(huán)境對辣椒素類物質(zhì)的影響提供了參考。而對于找到環(huán)境調(diào)控辣椒素類物質(zhì)含量變化的微效QTL位點(diǎn)以及某一環(huán)境因子對辣椒素類物質(zhì)含量的影響還需進(jìn)一步深入研究。

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· 蔬菜史話 ·

Zewdie Y，Bosland P W．2000b．Pungency of chile（Capsicum annuum L．）is affected by node position．HortScience，35：1174．

Analysis and QTLs Identification of Pepper Fruit Capsaicin Content under Different Cultivation Conditions

WANG Ning，ZHANG Zheng-hai，WANG Li-hao，ZHANG Bao-xi*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：In the present study，we constructed an intraspecific genetic map by using a recombinant inbred lines crossed by pungent pepper ‘Perennial’（Capsicum annuum） and non-pungent pepper ‘83-58’，and analyzed capsaicin and dihydrocapsaicin contents investigated on a test cross progeny by non-pungent pepper ‘77013A ’and RILs （‘83-58’בPerennial’） both in greenhouse and open fields. And the differences in capsaicin content，dihydrocapsaicin content，total capsaicinoids and capsaicin/dihydrocapsaicin ratio between greenhouse and open fields were obvious. We did QTL mapping on them and found 16 QTLs located in chromosome 2，4 and 12. The major QTL cap2.1，dhp2.1，C/D2.1 and （C+D）2.1 on chromosome 2 that controlling capsaicin content，dihydrocapsaicin content，total capsaicinoids content and capsaicin/dihydrocapsaicin ratio，was detected in both greenhouse and open fields. The LOD was above 5.0，accounting for 20.2%-76.6% of the phenotypic variation. The interval markers were BD76366 and Pun1. We also found minor QTLs in P12 that regulating total capsaicinoids content in 2 environments. Other minor QTLs were not detected at the same time in these 2 environments.

Key words：Pungency；Capsaicins；Environment；QTL

基金項目：公益研究所基金項目（1610032011011），國家“863”計劃項目（2012AA100103002），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），國家科技支撐項目（2011BAZ01732），創(chuàng)新工程農(nóng)業(yè)部大宗蔬菜技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系項目（CARS-25）

收稿日期：2015-04-16；接受日期：2015-06-02

*通訊作者（

Corresponding author）：張寶璽，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhangbx@caas.cn