血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9水平及其基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性的相關(guān)

董　翔　常　庚　陶定波

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧　大連　116011)

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血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9水平及其基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性的相關(guān)

董翔常庚陶定波

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧大連116011)

〔摘要〕目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性之間的相關(guān)性。方法選取2011年3月至2013年4月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且發(fā)病時(shí)間在48 h之內(nèi)的腦梗死患者271例，根據(jù)B超檢查結(jié)果，分為斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組，利用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)兩組患者血清MMP-9水平進(jìn)行檢測，采用PCR-酶切反應(yīng)過程對(duì)MMP-9基因多態(tài)性進(jìn)行測定。結(jié)果斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩(wěn)定組(P<0.05)；斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組T/T和C/T基因型頻率高于斑塊穩(wěn)定組，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI 1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組T/C的OR=1.56(95%CI 1.07～2.83，P<0.05)。結(jié)論MMP-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性密切相關(guān)，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點(diǎn)多態(tài)性測定作為臨床患者頸動(dòng)脈斑塊易損性判斷的早期標(biāo)志物。

〔關(guān)鍵詞〕基質(zhì)金屬蛋白酶-9；基因多態(tài)性；頸動(dòng)脈斑塊；腦梗死

腦梗死是嚴(yán)重危害老年人群健康的腦血管疾病，嚴(yán)重影響老年患者及家屬生活質(zhì)量〔1〕，早期發(fā)現(xiàn)腦梗死高危因素并采取積極的預(yù)防措施，對(duì)于減少腦梗死發(fā)生及改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。研究表明〔2,3〕，頸動(dòng)脈粥樣硬化是腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，頸動(dòng)脈斑塊的易損性是引發(fā)腦梗死的重要潛在危險(xiǎn)因素和病理基礎(chǔ)。因此，積極尋找影響頸動(dòng)脈斑塊易損性的可能因素顯得尤為重要。基質(zhì)金屬蛋白家族(MMPs)是一種鈣鋅離子依賴性蛋白酶超家族，主要在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解中發(fā)揮作用，有研究指出〔4,5〕，MMPs可以通過破壞斑塊結(jié)構(gòu)和纖維帽成分而造成斑塊加速破裂，從而影響斑塊的穩(wěn)定性。MMP-9是MMPs家族較為重要的成員之一，有研究報(bào)道〔6〕，粥樣斑塊內(nèi)MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá)。本研究通過探討腦梗死患者頸動(dòng)脈穩(wěn)定性和易損性斑塊患者之間MMP-9血清水平的差異，進(jìn)一步從基因水平上分析MMP-9基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性之間的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年3月至2013年4月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療且發(fā)病時(shí)間在48 h之內(nèi)的腦梗死患者271例，所有患者均行頸動(dòng)脈B超檢查，根據(jù)檢查結(jié)果，參照文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于頸動(dòng)脈斑塊分類標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：①斑塊穩(wěn)定組：B超下示頸動(dòng)脈呈高回聲，共計(jì)147例，男91例，女56例，平均年齡(64.7±13.4)歲；②斑塊易損組：B超下示頸動(dòng)脈斑塊呈低回聲，共計(jì)124例，男79例，女45例，平均年齡(66.3±11.7)歲。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)學(xué)會(huì)關(guān)于腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕，同時(shí)排除腦動(dòng)脈炎、心源性腦梗死等其他原因?qū)е碌哪X梗死，并發(fā)重要臟器衰竭的患者和嚴(yán)重全身感染者，以及患有惡性腫瘤和近2個(gè)月有服用降脂藥物或抗血小板治療等藥物史者。所有研究對(duì)象均進(jìn)行了知情同意。

1.2臨床資料收集記錄患者性別、年齡、血壓、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史等基本資料，并于入院第2日抽取患者晨起空腹血9 ml，分裝3支試管，5 ml用于生化檢查，采用日立7600-020型全自動(dòng)生化儀對(duì)患者空腹血糖(Glu)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進(jìn)行檢測；另外兩支試管各2 ml，一管用于基因組DNA抽取，另一管用于MMP-9血清含量檢測，兩者均凍存于-80℃冰箱備用。所有患者均采用彩色多普勒超聲儀對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)進(jìn)行檢測，IMT≥1.25 mm定義為粥樣斑塊。

1.3檢測試劑人MMP-9酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自廈門慧嘉生物，用于血清MMP-9血清水平檢測；Pfu DNA聚合酶購自美國Invitrogen公司，Tris飽和酚購自北京華越洋生物，限制性內(nèi)切酶PaeI及其緩沖液購自美國MBI公司，PCR純化試劑盒購自上海華工生物，并由上海華工生物完成DNA測序。

1.4MMP-9多態(tài)性檢測

1.4.1DNA的提取利用低滲溶血-酚法由白細(xì)胞中提取，利用KY009核酸蛋白測定儀對(duì)DNA進(jìn)行檢測，確定提取的濃度，并根據(jù)A260/A280值確定PCR擴(kuò)增模板。

1.4.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增MMP-9啟動(dòng)子區(qū)-1562C/T位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)，上游引物A為：5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物B為：5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為435 bp，反應(yīng)條件為緩沖液2.5 μl×10，dNTP(分別10 mmol/L)0.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，Pfu DNA聚合酶2 U，加RNase-Free Water至總體積達(dá)到25 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性120 s；94℃變性45 s；65℃退火70 s；72℃延伸90 s，反復(fù)循環(huán)34次，最終72℃延伸600 s。

1.4.3酶切反應(yīng)過程采用限制性內(nèi)切酶PaeI對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系包括：1 μg PCR產(chǎn)物，緩沖液2 μl×10，內(nèi)切酶PaeI 2.5 U，加RNase-Free Water至總體積達(dá)到20 μl，放置37℃水浴箱，進(jìn)行酶切16 h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行溴乙啶(EB)染色，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基因頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，P>0.05，說明符合H-W遺傳平衡定律，具有良好的代表性。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)，相對(duì)危險(xiǎn)度采用OR及其95%可信區(qū)間(CI)表示。

2結(jié)果

2.1兩組患者基本情況比較兩組患者基本情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩組性別、年齡、BMI、血壓、Glu、血脂等基本情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組一般情況比較±s)

2.2不同組患者血清MMP-9水平情況斑塊易損組患者血清MMP-9水平為(24.3±9.1)μg/L，明顯高于斑塊穩(wěn)定組〔(19.4±0.7)μg/L，t=3.821,P<0.001〕。

2.3MMP-9基因多態(tài)性分析結(jié)果采用PCR-酶切法對(duì)MMP-9基因多態(tài)性進(jìn)行分析，利用PaeI內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，如果為野生型純合子(基因型C/C)，沒有出現(xiàn)突變，則不能被酶切，只出現(xiàn)一條435 bp的帶；如果為突變型純合子(基因型T/T)，C完全突變?yōu)門，則完全被酶切，出現(xiàn)247 bp和188 bp兩條帶；如果為突變雜合子(基因型C/T)，則被部分酶切，出現(xiàn)435 bp、247 bp和188 bp三條帶，見圖1。

M：Marker；1、4、5：突變型純合子T/T；2：野生型純合子C/C；3：突變雜合子C/T圖1　MMP-9基因多態(tài)性酶切產(chǎn)物凝膠電游圖

2.4兩組患者基因型分布和等位基因分布情況比較斑塊穩(wěn)定組和斑塊易損組患者M(jìn)MP-9基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.151，P=0.922；χ2=1.327，P=0.159)，說明群體代表性較好。斑塊易損組MMP-9不同基因型頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組(TT+CT)/CC的OR=1.73(95%CI1.14～3.18，P<0.05)；斑塊易損組等位基因頻率分布與斑塊穩(wěn)定組相比差異顯著(P<0.05)，斑塊易損組與斑塊穩(wěn)定組T/C的OR=1.56(95%CI1.07～2.83，P<0.05)，見表2。

表2　兩組患者M(jìn)MP-9不同基因型頻率和等

3討論

越來越多的研究表明〔9,10〕，急性腦梗死的發(fā)生與頸動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，頸動(dòng)脈斑塊的易損破裂是造成腦梗死發(fā)生的直接原因。細(xì)胞外基質(zhì)是血管壁主要成分，可以保持斑塊的完整性，同時(shí)含有膠原物質(zhì)，能夠保持彈性與韌性，在防止斑塊破裂方面發(fā)揮重要作用，當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)被過度講解時(shí)，將增加斑塊的易損性，導(dǎo)致斑塊破裂。MMP-9主要參與膠原、彈性蛋白和纖維蛋白等的降解，可以破壞斑塊的穩(wěn)定性，增加斑塊易損性，在斑塊破裂過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。本研究提示MMP-9參與ECM的降解，與斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)。

MMP-9基因位于人染色體20q1 1.2～13.1，在其4個(gè)啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性中，-1562C/T位點(diǎn)變異可能與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，當(dāng)發(fā)生C→T突變后，可以產(chǎn)生低活性C/C和高活性C/T、T/T啟動(dòng)子基因，其中，C/T、T/T啟動(dòng)子基因可以引發(fā)MMP-9的高表達(dá)〔12〕，因此，MMP-9基因多態(tài)性決定了人群對(duì)某種疾病的遺傳易感性。本研究說明易損斑塊MMP-9基因發(fā)生了基因突變，(TT+CT)/CC比例增高增加了斑塊損傷的危險(xiǎn)性，高活性啟動(dòng)子基因大量產(chǎn)生，使MMP-9表達(dá)增多，從而進(jìn)一步加速斑塊的破損。斑塊易損組T基因頻率遠(yuǎn)高于斑塊穩(wěn)定組，說明在易損斑塊組發(fā)生了C→T突變，產(chǎn)生高活性的啟動(dòng)子基因型，使MMP-9高表達(dá)，進(jìn)一步破壞斑塊的穩(wěn)定性。從基因水平也解釋了斑塊易損組患者血清MMP-9水平高于斑塊穩(wěn)定組的原因。

綜述所述，MMP-9血清水平及其基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊易損性密切相關(guān)，其中，-1562C/T位點(diǎn)是頸動(dòng)脈斑塊易損性的易感基因，其多態(tài)性直接影響斑塊的穩(wěn)定性。因此，可以將血清MMP-9水平檢測和-1562C/T位點(diǎn)多態(tài)性測定作為臨床患者頸動(dòng)脈斑塊易損性判斷的早期標(biāo)志物，對(duì)其危險(xiǎn)性進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而早期發(fā)現(xiàn)易感人群，開展早期的干預(yù)，預(yù)防頸動(dòng)脈斑塊易損性的發(fā)生，進(jìn)而降低腦梗死的發(fā)生率。

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〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號(hào)〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1344-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.028

通訊作者：常庚(1981-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事癡呆研究。

第一作者：董翔(1975-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。