趨化素樣因子1在大鼠腹主動(dòng)脈瘤病情發(fā)展中的作用

莊　暉　郭平凡　詹騰輝

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，福建　福州　350005)

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趨化素樣因子1在大鼠腹主動(dòng)脈瘤病情發(fā)展中的作用

莊暉郭平凡詹騰輝

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，福建福州350005)

〔摘要〕目的探討氫氣抑制趨化素樣因子1(Cklf1)在大鼠腹主動(dòng)脈瘤病情發(fā)展中的作用。方法取雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為腹主動(dòng)脈瘤組和腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組(腹腔注射氫氣飽和生理鹽水)，建立腹主動(dòng)脈瘤模型。術(shù)后28 d開腹取材，觀察腹主動(dòng)脈擴(kuò)張情況，采用蘇木素-伊紅(HE)染色和彈力纖維染色檢測(cè)炎癥浸潤(rùn)和腹主動(dòng)脈中膜彈力纖維破壞情況，免疫組化法檢測(cè)Cklf1(rCklf1)、金屬蛋白酶(MMP2)蛋白表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)rCklf1、MMP2基因表達(dá)情況。結(jié)果腹主動(dòng)脈瘤組大鼠腹主動(dòng)脈擴(kuò)張率明顯高于腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組(P<0.01)。腹主動(dòng)脈瘤組大鼠瘤壁rCklf1 mRNA、MMP2 mRNA表達(dá)量均明顯高于腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組(P<0.01)；rCklf1、MMP2主要在腹主動(dòng)脈瘤壁中層病變嚴(yán)重區(qū)域表達(dá)上調(diào)；與腹主動(dòng)脈瘤組相比，干預(yù)組rCklf1、MMP2陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱，炎癥浸潤(rùn)、彈力纖維破壞程度明顯減輕。結(jié)論氫氣可通過抑制rCklf1表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞向腹主動(dòng)脈受損區(qū)域聚集，降低MMP2表達(dá)合成，減緩中膜彈力纖維降解，干預(yù)腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)展。

〔關(guān)鍵詞〕腹主動(dòng)脈瘤；趨化素樣因子1

腹主動(dòng)脈瘤為老年性疾病之一，多數(shù)在動(dòng)脈硬化基礎(chǔ)上發(fā)生。趨化素樣因子1(Cklfl)具有趨化因子的結(jié)構(gòu)特征和功能。相關(guān)研究顯示，腹主動(dòng)脈瘤體組織中趨化因子表達(dá)明顯增強(qiáng)，在病情進(jìn)展中能夠準(zhǔn)確調(diào)控白細(xì)胞向炎性組織遷移〔1〕。已有研究顯示，氫氣可成為一種新的治療炎性疾病的特效藥物，其主要機(jī)制為抑制趨化因子表達(dá)〔2〕。本研究擬探究大鼠Cklfl(rCklf1)在受氫氣飽和生理鹽水干預(yù)后對(duì)腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑SPF級(jí)雄性SD大鼠，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司；氫氣飽和生理鹽水購(gòu)于濟(jì)南紅杉樹健康科技有限公司；兔源rCklf1多克隆抗體由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)贈(zèng)予；兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)于江蘇溥博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、通用引物Oligo(dT)Primer購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2方法①實(shí)驗(yàn)分組：取雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量190～210 g，根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)，隨機(jī)分為腹主動(dòng)脈瘤組和腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組，每組10只。其中腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組大鼠腹腔注射氫氣飽和生理鹽水6 ml·kg-1·d-1；腹主動(dòng)脈組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水；上述注射操作從造模成功日起到取動(dòng)脈瘤組織日結(jié)束，注射1次/d。②建模和標(biāo)本采集：腹主動(dòng)脈瘤模型建立完全按照Lenburg等〔3〕研究的方法。從造模成功后第28天，打開大鼠腹腔，分離腹主動(dòng)脈段，取其中一半長(zhǎng)度置于4%甲醛溶液中固定，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化染色、特殊染色。余下的另一半置于-80℃冰箱中，用于RT-PCR檢測(cè)。③指標(biāo)檢測(cè)：腹主動(dòng)脈直徑測(cè)量完全按照Chiou等〔4〕研究方法；rCklf1和MMP2 mRNA相對(duì)定量檢測(cè)中RCR引物：rCklf1上游引物：5′ACGCCGCGCCTCCCAGAATT3′；下游引物：5′ACGAGAGGTCCTGAGCGCGT3′。MMP2上游引物：5′CGACTATGACTGTGACCATGAC3′；下游引物：5′GTTAGAAAAGACCCTCGAGATG3′。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1大鼠腹主動(dòng)脈瘤大體形態(tài)造模后大鼠腹主動(dòng)脈最大直徑較造模前增加50%以上可診斷為腹主動(dòng)脈瘤，本研究?jī)山M大鼠均達(dá)到該診斷標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率100%。腹主動(dòng)脈瘤組大鼠腹主動(dòng)脈擴(kuò)張率為(163±34)%，明顯高于腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組大鼠的(85±39)%(t=18.299，P=0.000)。

2.2HE染色和彈力纖維染色HE染色顯示腹主動(dòng)脈瘤組大鼠動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)破壞、厚度增加，平滑肌細(xì)胞排列不整，多數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組大鼠動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)完整、厚度無(wú)明顯改變，平滑肌分布整齊，炎性細(xì)胞數(shù)量明顯多于腹主動(dòng)脈瘤組。彈力纖維染色顯示，腹主動(dòng)脈瘤組大鼠動(dòng)脈中膜彈力纖維層次不清，形態(tài)無(wú)規(guī)律，層數(shù)減少，存在碎片、斷裂，無(wú)原有的連續(xù)性和曲度；腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組大鼠彈力纖維總體結(jié)構(gòu)較為完整，層次清晰，連續(xù)性和曲度較好，見圖1，圖2。

2.3免疫組化染色分別進(jìn)行免疫組化rCklf1、MMP2特異性蛋白染色，腹主動(dòng)脈瘤組大鼠動(dòng)脈瘤組織結(jié)構(gòu)顯示強(qiáng)陽(yáng)性棕黃色染色，rCklf1、MMP2高表達(dá)多分布在動(dòng)脈瘤管壁中層碎片、斷裂等病變嚴(yán)重區(qū)域；腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組rCklf1、MMP2表達(dá)均呈現(xiàn)弱陽(yáng)性，見圖3、圖4。

圖1　術(shù)后28 d兩組腹主動(dòng)脈HE染色(×400)

圖2　術(shù)后28 d兩組腹主動(dòng)脈彈力纖維染色(×400)

圖3　術(shù)后28 d兩組腹主動(dòng)脈rCklf1染色(×400)

圖4　術(shù)后28 d兩組腹主動(dòng)脈MMP2染色(×400)

2.4RT-PCR檢測(cè)結(jié)果rCklf1 mRNA在腹主動(dòng)脈瘤組動(dòng)脈瘤組織中相對(duì)含量(4.90±0.47)明顯高于腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組(1.45±0.30)(t=18.399，P=0.000)；MMP2在腹主動(dòng)脈瘤組動(dòng)脈瘤組織中相對(duì)含量(11.39±0.52)明顯高于腹主動(dòng)脈瘤干預(yù)組(3.57±0.86)(t=16.359，P=0.000)。rCklf1 mRNA與MMP2 mRNA變化之間呈明顯正相關(guān)(r=0.840，P=0.006)。

3討論

炎癥參與了腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病，其中趨化因子調(diào)控淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的活化、轉(zhuǎn)移是啟動(dòng)腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病的關(guān)鍵〔5〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腹主動(dòng)脈瘤血管組織中趨化因子明顯高表達(dá)，在趨化因子的引導(dǎo)下血液中淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)于動(dòng)脈血管壁，分泌出大量MMP，促使動(dòng)脈管壁中包括膠原蛋白、彈力蛋白等在內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白降解，損傷膠原纖維和彈力纖維，其中彈力纖維受損在腹主動(dòng)脈瘤形成過程中具有重要地位〔6,7〕。Cklfl在體內(nèi)和體外均對(duì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞有明顯的趨化活性，與動(dòng)脈硬化、內(nèi)膜增生等炎癥進(jìn)程有明顯關(guān)聯(lián)?？紤]到Cklfl的特殊結(jié)構(gòu)和功能，我們推測(cè)Cklfl可能參與了腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病。氫氣對(duì)所有嚴(yán)重相關(guān)疾病均具有較好的療效，主要機(jī)制為抑制趨化因子的表達(dá)。在內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠中，氫氣可通過下調(diào)趨化因子表達(dá)，來緩解組織中炎性細(xì)胞聚集，減輕炎癥對(duì)機(jī)體組織的傷害〔8〕。

本文提示，在腹主動(dòng)脈瘤形成早期可采用藥物、基因等治療手段抑制Cklfl的表達(dá)，還可使用Cklfl受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑來干預(yù)動(dòng)脈瘤的形成過程。此外，氫氣能夠有效干預(yù)腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)程，在倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，可進(jìn)行多中心試驗(yàn)來驗(yàn)證氫氣抑制腹主動(dòng)脈瘤。臨床上對(duì)于瘤體直徑>5.5 cm的大腹主動(dòng)脈瘤，應(yīng)盡早行動(dòng)脈瘤切除術(shù)治療；但80%以上的腹主動(dòng)脈瘤直徑<5.5 cm，外科手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)高于收益，對(duì)于此類患者只能通過定期隨訪檢測(cè)瘤體變化，待直徑>5.5 cm時(shí)給予手術(shù)治療。

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〔2015-07-10修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R65

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1287-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.003

基金項(xiàng)目：福建省自然科學(xué)基金(No.2014J01323)

第一作者：莊暉(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事下肢血管疾病、內(nèi)臟血管疾病、主動(dòng)脈疾病及血管畸形研究。