艾拉莫得治療大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的療效及可能機制

鄒惠美　成沛玉　王　蓉

(南華大學(xué)護理學(xué)院，湖南　衡陽　421001)

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艾拉莫得治療大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的療效及可能機制

鄒惠美成沛玉1王蓉

(南華大學(xué)護理學(xué)院，湖南衡陽421001)

〔摘要〕目的探討艾拉莫得(T-614)對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠的治療作用及可能機制。 方法通過牛Ⅱ型膠原(CⅡ)和不完全弗氏佐劑混合的膠原乳劑免疫大鼠，建立CIA模型，CIA大鼠隨機被分為模型組、甲氨蝶呤(MTX)組、T-614高劑量組和T-614低劑量治療組。其中藥物干預(yù)組大鼠分別用甲氨蝶呤、高劑量T-614和低劑量T-614連續(xù)干預(yù)3 w。關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI) 評分評價大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度，HE染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清中抗CⅡ-IgG抗體及其兩種亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度，ELISA試劑盒檢測血清白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ水平。 結(jié)果藥物干預(yù)3 w后，與模型組相比，T-614高劑量組的AI評分、病理學(xué)評分、IgG及其亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度和3種細胞因子含量均降低(P<0.05)。 結(jié)論T-614能夠積極改善CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的癥狀，并可能通過降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性細胞因子和IgG抗體的表達而發(fā)揮抑制關(guān)節(jié)炎癥病程發(fā)展的作用。

〔關(guān)鍵詞〕艾拉莫得；膠原性誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎；抗CⅡ-IgG抗體；炎性細胞因子

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。RA的基本病理特征是炎癥細胞浸潤、滑膜細胞大量增殖和血管翳的生成，并最終引起關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞。而T淋巴細胞的活化及其炎性細胞因子表達的增加在RA的疾病發(fā)展過程中起到了非常重要的作用〔2〕。艾拉莫德(T-614)是全球第一個具有我國完全自主知識產(chǎn)權(quán)的抗風(fēng)濕新藥，目前該藥已于2011年經(jīng)國家批準上市并在臨床上用于治療RA且取得了良好的效果〔3〕。T-614在治療RA過程中所發(fā)揮藥理作用的相關(guān)實驗研究報道甚少，不同劑量的T-614對抑制RA炎癥反應(yīng)的機制仍不明確。本實驗擬通過觀察T-614對膠原活導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠的治療作用，探究其對CIA大鼠淋巴細胞活化及其炎性細胞因子表達影響的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級雌性Wistar成年大鼠50只，體重(170±10)g。飼養(yǎng)條件：SPF級動物房，光照/黑暗:12 h/12 h，標準飼料，清潔飲水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑及藥物牛Ⅱ型膠原(CⅡ，Sigma公司)，不完全弗氏佐劑(Sigma公司)；甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司)，艾拉莫得片(南京先聲藥業(yè)有限公司)；抗大鼠免疫球蛋白G(IgG) 抗體及抗大鼠IgG1、IgG2a 抗體(Bethyl公司)；白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ干擾素(IFN-γ) 的ELISA試劑盒(Bender-MedSystems公司，奧地利)。

1.3造模與分組50只大鼠預(yù)先制備CIA模型。以牛CⅡ與不完全弗氏佐劑制備成終濃度為2 g/L的免疫混合乳劑，于每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射免疫乳劑150 μl，同樣的方法于7 d后加強免疫1次。初次免疫后第10天起每天觀察造模大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病情況，并行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分。共有43只造模大鼠第1次AI評分≥5分，顯示造模成功，從其中選取40只隨機分成模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組，每組各10只。初次免疫第14天起開始灌胃，MTX組給予MTX灌胃(2.5 mg·kg-1·w-1)，T-614高劑量組給予10 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，T-614低劑量組給予5 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，模型組給予生理鹽水作為對照。灌胃連續(xù)3 w，直至初次免疫第34天。

1.4AI評分初次免疫后第10天起對造模大鼠關(guān)節(jié)炎進行評分。評分標準依照AI 0～4級評分法〔3〕。于初次免疫第10天起直至第34天每4天記錄1次關(guān)節(jié)炎評分。

1.5病理形態(tài)學(xué)觀察及評分各組大鼠于灌胃3 w后(初次免疫后第34天)取血后處死，取大鼠踝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛中固定16 h，10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣，脫水、包埋，切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)組織病理變化。病理評分標準參照Tsubaki等〔4〕于2005年提出的評分方法。

1.6血清中抗CⅡ-IgG及其亞型抗體和炎性細胞因子的檢測分離大鼠血清，應(yīng)用ELISA法檢測血清中抗CⅡ-IgG及其兩種亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度，在450 nm波長下測定光密度值；分別應(yīng)用IL-1β、TNF-α和IFN-γ的ELISA試劑盒對大鼠血清中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平進行檢測，操作過程嚴格按照說明書執(zhí)行。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠體重變化及AI評分實驗結(jié)束時模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠體重比免疫前分別增加了(7.8±5.1) g、(19.8±7.3)g、(20.5±7.9) g和(18.1±6.7) g ；雖然各治療組的大鼠體重增加都大于模型組，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗結(jié)束時模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠AI評分分別為(7.600±1.694)、(3.700±1.473)、(3.100±0.548)、(3.900±1.176)，與模型組比較，其他各組AI評分均顯著降低(P<0.05)。初次免疫后第10天、14天、18天、22天、26天、30天、34天關(guān)節(jié)炎評分，見表1。

表1　各組CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評分

與模型組比較:1)P<0.05，下表同

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)病理形態(tài)改變及病理評分HE染色結(jié)果顯示模型組有大量炎癥細胞浸潤，同時伴有滑膜細胞增生和血管翳生成，部分軟骨及骨質(zhì)有明顯破壞。而MTX組和T-614各治療組炎癥細胞浸潤和滑膜細胞增生較輕，少見血管翳生成，軟骨和骨質(zhì)破壞不明顯。與模型組相比，T-614高劑量組可明顯抑制病變的發(fā)展(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1　各組大鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)改變(HE)

組別總分滑膜增生炎細胞浸潤新生血管模型組0.742±0.0790.482±0.0020.197±0.0530.281±0.159MTX組0.653±0.1291)0.287±0.1491)0.171±0.0280.218±0.1521)T-614高劑量組0.581±0.1171)0.226±0.1211)0.049±0.0061)0.203±0.1391)T-614低劑量組0.657±0.1201)0.389±0.1841)0.051±0.0211)0.278±0.193

2.3各組大鼠血清中抗CⅡIgG及其亞型IgG1、IgG2a水平在模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠血清中，抗CⅡIgG滴度的光密度值分別為1.82±0.84、1.32±0.57、1.17±0.63和1.59±0.93，雖然T-614低劑量組與模型組相比較低，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而T-614高劑量組則明顯低于模型組(P<0.05)；亞型IgG1分別為0.36±0.17、0.23±0.11、0.14±0.03及0.33±0.14，T-614高劑量組相對于模型組明顯降低(P<0.05)，而T-614低劑量組和模型組之間沒有明顯差異；亞型IgG2a分別為0.87±0.63、0.51±0.34、0.43±0.31 和0.46± 0.28，相比模型組，T-614高劑量組和T-614低劑量組都明顯降低(P<0.05)。

2.4各組大鼠血清細胞因子水平通過藥物干預(yù)后，MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組的血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ含量均明顯低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠血清IL-1β、TNF-α和

3討論

RA是自身免疫性疾病的典型代表之一，T細胞異?；罨只癁椴煌δ艿膩喨?，產(chǎn)生大量炎性細胞因子，導(dǎo)致關(guān)節(jié)損害〔5，6〕。IL-1β、TNF-α和IFN-γ是RA致病的關(guān)鍵因子，與RA病程進展密切相關(guān)〔7〕。

T-614是國家食品藥品監(jiān)督管理局臨床批準的Ⅰ類新藥，于2011年8月獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局批準，用于治療成人活動性RA〔8〕。在T-614的相關(guān)基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，T-614對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細胞TNF-α等炎性因子水平的上調(diào)有顯著抑制作用〔9〕。本結(jié)果顯示兩種不同劑量T-614治療組中血清中IL- 1β、TNF-α和IFN-γ的水平均顯著降低，其中高劑量組更顯著。高劑量T-614可明顯減輕關(guān)節(jié)的炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增殖、血管翳生成和骨質(zhì)破壞，可見T-614對CIA病程進展的抑制作用。

同時RA是一種T細胞活化異常的自身免疫病，其中抗CⅡ抗體IgG兩種亞型的表達就與Th1、Th2有著非常緊密的聯(lián)系。Th1可以促進IgG2a的產(chǎn)生，而Th2則促進IgG1的產(chǎn)生〔10〕。艾拉莫德不僅能夠抑制載脂蛋白Ⅱ抗體水平而且還能分別調(diào)控免疫球蛋白亞群的水平，并呈劑量依賴性〔11〕。本研究結(jié)果說明T-614可以抑制T細胞免疫反應(yīng)從而發(fā)揮治療作用。而低劑量的T-614只能影響IgG2a的水平，這提示IgG2a可能在T-614對CIA的抑制機制中發(fā)揮著中心作用。

不同于傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥，T-614對禁食老鼠沒有表現(xiàn)出消化道潰瘍類的不良反應(yīng)〔12〕，在2期臨床試驗過程中，患者的常見不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯低于對照組尼美舒利，這也證實T-614有更好的耐受性和安全性〔13〕。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型的炎癥呈持續(xù)性發(fā)展，并且沒有自限傾向，這些特征甚至包括某些臨床表現(xiàn)都非常接近于人類RA〔14〕，因此本實驗也采用了這種動物模型。

4參考文獻

1孫琳,李常虹,鄭曉娟，等.烏司他丁治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的實驗研究〔J〕.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013;45(5):823-6.

2Smigielska-Czepiel K,van den Berg A,Jellema P,etal.Comprehensive analysis of miRNA expression in T-cell subsets of rheumatoid arthritis patients reveals defined signatures of naive and memory Tregs〔J〕.Genes Immun,2014;15(2):115-25.

3劉丹,陳妤,丁漢飛,等.艾拉莫德(T-614) 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎基礎(chǔ)實驗與臨床療效的研究進展〔J〕.中國新藥雜志,2013;22(9):1052-5.

4Tsubaki T,Arita N,Kawakami T,etal.Characterization of histopathology and gene-expression profiles of synovitis in early rheumatoid arthritis using targeted biopsy specimens〔J〕.Arthrit Res Ther,2005;7(4):825-36.

5林輝,周燕莉,李箭.關(guān)節(jié)液TH17細胞變化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫炎癥中的作用〔J〕.四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013;44(6):907-10.

6komatsu N，Takayanagi H.Autoimmune arthritis：the interface between the immune system and joints〔J〕.Adv Immunol,2012;115：45-71.

7Zhang YC,Wang F,Wang WY,etal.New drug for rheumatoid arthritis:iguratimod〔J〕.World Clin Drugs,2013;34(2):65-9.

8郝春芳,劉毅,趙毅.艾拉莫德在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的研究〔J〕.華西醫(yī)學(xué),2013;28(5):795-8.

9蔣葉,呂偉,余書勤.艾拉莫德對脂多糖激活大鼠肺泡巨噬細胞系TNFA產(chǎn)生及NF-JB活性的抑制作用〔J〕.藥學(xué)學(xué)報,2006;41(5):401-5.

10Hayashi T,Shimoyama N,Mizuno T,etal.Destruction of salivary and lacrimal glands by Th1-polarized reaction in a model of secondary Sj?gren's syndrome in lupus-prone female NZB×NZWF(1) mice〔J〕.Inflammation,2012;35(2):638-46.

11Du F,Lü LJ,Fu Q,etal.T-614,a novel immunomodulator,attenuates joint inflammation and articular damage in collagen induced arthritis〔J〕.Arthritis Res Ther,2008;10(6):1-11.

12Ishiguro N,Yamamoto K,Katayama K,etal.Iguratimod-Clinical Study Group Concomitant iguratimod therapy in patients with active rheumatoid arthritis despite stable doses of methotrexate:a randomized,double-blind,placebo-controlled trial〔J〕.Mod Rheumatol,2013;23(3):430-9.

13魏偉,張玲玲,肖峰,等.艾拉莫德治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Ⅱ期臨床試驗〔C〕.武漢：第十二次全國臨床藥理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集,2010.

14Kogure M,Mimura N,Ikemoto H,etal.Moxibustion at mingmen reduces inflammation and decreases IL-6 in a Collagen-induced arthritis mouse model〔J〕.Acupunct Meridian Stud,2012;5(1):29-33.

〔2014-11-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.017

通訊作者：成沛玉(1967-)，女，碩士，主任護師，碩士生導(dǎo)師，主要從事護理管理、教學(xué)及相關(guān)科研工作。

1湘潭市第一人民醫(yī)院

第一作者：鄒惠美(1989-)，女，在讀碩士，主要從事護理管理、教學(xué)及相關(guān)科研工作。