高糖因素在人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)體凝集素途徑激活機(jī)制的作用

樊文星　肖　樺　楊秋萍　黃　潔　黃頌敏

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，云南　昆明　650032)

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高糖因素在人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)體凝集素途徑激活機(jī)制的作用

樊文星肖樺楊秋萍1黃潔黃頌敏2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，云南昆明650032)

〔摘要〕目的觀察高濃度葡萄糖對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)表面補(bǔ)體凝集素途徑(LCP)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。方法將HRGEC分3組：高糖組、正常糖組和甘露醇組，分析HRGEC細(xì)胞表面甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、C3及C5b-9沉積的變化。結(jié)果HRGEC表面MBL和C3沉積隨糖作用時(shí)間的延長而增加，72 h達(dá)峰值(P<0.05)，隨糖濃度的升高而增加，60 mmol/L達(dá)峰值(P<0.05)；高糖組HRGEC表面MBL、C3及C5b-9沉積均明顯高于正常糖組和甘露醇組(P<0.05)。結(jié)論葡萄糖可隨時(shí)間及濃度依賴性促進(jìn)HRGEC表面MBL和C3沉積；高濃度葡萄糖刺激可能氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HRGEC表面糖基化發(fā)生改變，激活LCP途徑，引發(fā)HRGEC表面C5b-9沉積的增加。

〔關(guān)鍵詞〕高糖；人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞；補(bǔ)體凝集素途徑；激活

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的重要微血管并發(fā)癥之一，也是慢性腎衰竭的主要原因。高血糖是DN發(fā)病的主要環(huán)境因素，高血糖可引起多元醇代謝通路激活、蛋白質(zhì)非酶糖基化、蛋白激酶C過度活化，促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展。DN發(fā)病過程中，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞位于血液與組織接觸處，最先接觸血液中的各種致病因子，為各種病理生理因素作用的自然靶細(xì)胞。當(dāng)DM血糖異常持續(xù)升高而引發(fā)細(xì)胞功能紊亂時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞便成為首當(dāng)其沖的受害者〔1，2〕。本文擬采用人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)，體外模擬高糖狀態(tài)下補(bǔ)體凝集素途徑(LCP)激活，設(shè)置不同的糖濃度和作用時(shí)間，觀察HRGEC表面甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、C3及補(bǔ)體攻膜復(fù)合體(MAC)沉積的變化，探討高糖因素在HRGEC的LCP激活機(jī)制中的作用。

1材料與方法

1.1試劑及儀器HRGECs、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)、胎牛血清(FBS)和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)購自ScienCell公司；甘露聚糖、Sepharose 4B、胰蛋白酶和抗人vWF抗體購自Sigma公司；小鼠抗人MBL單克隆抗體購自Hycult Biotechnology公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記小鼠抗人C3單克隆抗體購自LifeSpan公司；鏈霉親和素-PE/Cy5購自Biolegend公司；小鼠抗人C5b-9單克隆抗體購自Santa Cruz公司；重組人MBL購自R&D公司。EPICS-XL型流式細(xì)胞儀：Beckman-Coulter公司；倒置顯微鏡：Olympus CK40；正置熒光顯微鏡：Olympus BX51；水平電泳儀：BIO-RAD公司；Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將HRGEC加入ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80%融合，用0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化細(xì)胞5 min，加含5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基4 ml終止消化，收集細(xì)胞懸液，離心，接種于已裝有ECM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種密度5×104個(gè)/ml，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，取第6代HRGEC。

1.3高濃度葡萄糖作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞LCP通路激活的影響HRGEC予以30 mmol/L葡萄糖ECM培養(yǎng)基，分別作用0、12、24、48和72 h，更換培養(yǎng)液，加入30%MBL-Def HS+外源性MBL 1 μg/ml，作用4 h。

1.4不同葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞LCP通路激活的影響HRGEC分別給予0、15、30和60 mmol/L的葡萄糖ECM培養(yǎng)基刺激72 h，更換培養(yǎng)液，其余操作同1.3。

1.5不同干預(yù)條件對(duì)細(xì)胞LCP通路激活的影響高糖組：葡萄糖30 mmol/L的ECM培養(yǎng)基刺激72 h，更換培養(yǎng)液，其余操作同1.3；正常糖組：葡萄糖5 mmol/L+甘露醇25 mmol/L ECM培養(yǎng)基刺激72 h，其余操作同高糖組；甘露醇組：甘露醇30 mmol/L ECM培養(yǎng)基刺激72 h，其余干預(yù)條件同于高糖組。

1.6指標(biāo)檢測采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光檢測HRGEC細(xì)胞表面MBL、C3及C5b-9沉積的變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1高濃度葡萄糖作用時(shí)間對(duì)HRGEC表面MBL和C3沉積的影響HRGEC表面MBL和C3沉積隨30 mmol/L葡萄糖的作用時(shí)間的延長而呈現(xiàn)遞增趨勢(P<0.05)，72 h達(dá)高峰，見表1。

表1　高濃度葡萄糖作用時(shí)間對(duì)HRGEC表面MBL和

與0 h比較：1)P<0.05

2.2不同葡萄糖濃度對(duì)HRGEC表面MBL和C3沉積的影響HRGEC表面MBL和C3沉積隨體外葡萄糖濃度升高而遞增(P<0.05)，60 mmol/L達(dá)峰值，見表2。

2.3不同干預(yù)條件對(duì)HRGEC表面MBL和C3沉積的影響與正常糖及甘露醇組比，高糖組HRGEC表面MBL和C3沉積明顯增高(P<0.05)，見表3。

表2　不同葡萄糖濃度對(duì)HRGEC表面MBL和

與0 mmol/L組比較：1)P<0.05

表3　不同體外干預(yù)條件對(duì)HRGEC表面MBL和

與正常糖組比較：1)P<0.05；與甘露醇組比較：2)P<0.05

2.4不同干預(yù)條件對(duì)HRGEC表面C5b-9沉積熒光強(qiáng)度的影響高糖組C5b-9(20.93±1.25),與正常糖組(0.93±0.15)及甘露醇組(0.87±0.15)比，沉積熒光強(qiáng)度明顯增高，見圖1。

圖1　不同干預(yù)條件對(duì)HRGEC表面C5b-9沉積熒光強(qiáng)度的影響(×400)

3討論

MBL是肝細(xì)胞分泌的血清糖蛋白，屬于C型凝集素超家族中膠凝素家族成員，是天然免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別分子。成熟MBL肽鏈自N端至C端依次分為：富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(CLR)、頸區(qū)和C端糖識(shí)別區(qū)(CRD)。CRD是MBL分子識(shí)別功能區(qū)，可選擇性識(shí)別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu)；CLR是MBL分子效應(yīng)功能區(qū)，MBL可通過此區(qū)與MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASPs)結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可激活MASPs酶原，活化的MASPs酶原可激活與CLR相結(jié)合的MASPs(如MASP-2和MASP-1)，活化的MASP-2和MASP-1可間接或直接裂解C3，形成C5轉(zhuǎn)化酶，激活LCP，形成末端效應(yīng)產(chǎn)物C5b-9沉積于細(xì)胞表面。因此通過考察MBL(啟動(dòng)因子)、C3(中心環(huán)節(jié))和C5b-9(末端效應(yīng)產(chǎn)物)表達(dá)可以驗(yàn)證LCP激活過程〔3~6〕。

本文結(jié)果提示葡萄糖刺激時(shí)間和刺激濃度均可顯著影響細(xì)胞表面LCP激活。HRGEC表面“MBL+C3共表達(dá)”及C5b-9沉積可代表著整個(gè)LCP激活的過程，本文結(jié)果表明高濃度的葡萄糖可促進(jìn)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞整個(gè)LCP激活過程，這種促進(jìn)作用可能與滲透壓無關(guān)。

高血糖引發(fā)的過氧化產(chǎn)物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DM慢性并發(fā)癥機(jī)制中關(guān)鍵性的第一步。體內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)：高血糖能夠直接引發(fā)DM患者和正常受試者的血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)減弱〔7，8〕，此效應(yīng)是由自由基介導(dǎo)的，能夠被抗氧化劑所逆轉(zhuǎn)〔9，10〕。細(xì)胞缺氧和氧自由基的形成可能使細(xì)胞表面某些基團(tuán)發(fā)生糖基化改變，導(dǎo)致細(xì)胞表面MBL沉積增加和LCP激活〔11~13〕。內(nèi)皮細(xì)胞位于血液與組織接觸處，這使它成為自身內(nèi)皮細(xì)胞或者炎癥反應(yīng)中的粒細(xì)胞產(chǎn)生的氧化劑的一種潛在靶目標(biāo)〔13〕。Collard等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮氧化應(yīng)激可能通過改變細(xì)胞膜表面的糖基化作用而引起LCP激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞表面MBL和C3沉積均明顯增加。根據(jù)上述結(jié)果，推測高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可能誘導(dǎo)HRGEC表面某些基團(tuán)發(fā)生糖基化改變，發(fā)生糖基化改變的基團(tuán)被MBL分子的CRD選擇性識(shí)別和結(jié)合，從而激活MASPs酶原，使通過CLR與MBL分子相結(jié)合的MASPs活化，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)LCP途徑激活。

綜上，葡萄糖可時(shí)間及濃度依賴性促進(jìn)HRGEC表面MBL和C3沉積；高濃度葡萄糖刺激可能氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HRGEC表面糖基化發(fā)生改變，激活LCP途徑，引發(fā)HRGEC表面C5b-9沉積的增加。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

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〔中圖分類號(hào)〕R692.6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1035-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.005

基金項(xiàng)目：2013年度云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(No.2013Y289)

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干療科2四川大學(xué)華西醫(yī)院腎臟內(nèi)科

第一作者：樊文星(1981-)，男，醫(yī)學(xué)博士，講師，主治醫(yī)師，主要從事腎臟病研究。