腦通湯對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用*

何　筑， 況時(shí)祥， 張樹森， 鄒家莉

(1.貴陽市第三人民醫(yī)院， 貴州 貴陽　550000； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽　550003)

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·基礎(chǔ)研究·

腦通湯對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用*

何筑1， 況時(shí)祥2**， 張樹森2， 鄒家莉2

(1.貴陽市第三人民醫(yī)院， 貴州 貴陽550000； 2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽550003)

[摘要]目的： 探討腦通湯對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法： 將大鼠原代BMECs培養(yǎng)傳代至第二代，分為對(duì)照組、正常血清組、缺氧-復(fù)氧模型組、大、中、小劑量腦通湯含藥血清組，后5組細(xì)胞均放入三氣培養(yǎng)箱中持續(xù)通入95% N2和5% CO2混合氣體缺氧24 h再復(fù)氧2 h制作腦缺血再灌注細(xì)胞模型；采用MTT法檢測缺氧24 h和復(fù)氧2 h時(shí) BMECs的活性并計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果： 缺氧24 h時(shí)，模型組的BMECs的活性及存活率較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，與正常血清組及各劑量含藥血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)氧2 h時(shí)各劑量含藥血清組BMECs的活性及存活率均較模型組明顯升高(P<0.05)，正常血清組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表達(dá)量均升高(P<0.05)，與模型組比較，各劑量含藥血清組的HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)量明顯升高，MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯下降，腦通湯大、中劑量組變化更顯著(P<0.01)；正常血清組與模型組比較上述3種mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： 腦通湯可以保護(hù)缺氧-復(fù)氧損傷的BMECs，其機(jī)制可能與其能上調(diào)HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)以及下調(diào)MMP-9 mRNA表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腦通湯； 缺血再灌注； 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞； 血腦屏障； 通透性

缺血性腦血管病是導(dǎo)致血管性癡呆(vascular dementia,VD) 的主要病因[1]，缺血再灌注損傷參與并介導(dǎo)了缺血性腦血管病的重要病理生理過程[2]。研究認(rèn)為血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)結(jié)構(gòu)及功能的損傷不僅參與腦缺血再灌注損傷的病理生理[3]，也與VD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是檢測BBB的結(jié)構(gòu)及功能損傷時(shí)常用到的指標(biāo)。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endoth-elial Cells,BMECs)是各種生理、病理因素作用的靶細(xì)胞。本課題組前期的研究證實(shí)腦通湯可以有效改善VD早期患者認(rèn)知功能[5]。本實(shí)驗(yàn)利用離體培養(yǎng)大鼠腦BMECs制備體外細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷,觀察腦通湯對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷BMECs中HIF-1α，VEGF,MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，探討腦通湯對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷BMECs的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體重：(200±20)g，購自于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0005。 1周齡SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，購自于貴陽學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(黔)2012-0001。

1.2主要藥品與試劑

腦通湯(中藥成分) 由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供。高糖DMEM、0.25%胰酶、雙抗均購于Hyclone公司， MTT、二甲基亞砜、鼠尾明膠、膠原酶II均購于Sigma公司，羊抗兔IgG-FITC、ICAM-1(CD54，批號(hào)PB0054)均購于博士德公司；Ⅷ因子相關(guān)抗原抗血清(北京博奧森)，胎牛血清(四季青)，無糖DMEM(Gibco)，Trizol(批號(hào)1596-026，invitrogen)，SYBR Green PCR 試劑盒(批號(hào)K0223，Thero)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)K1622，F(xiàn)ermentas)。

1.3腦通湯含藥血清的制備

腦通湯(黃芪40 g、西洋參8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)每劑方藥152 g，加水500 mL煎制，醇沉提取，高溫消毒，制成含生藥量為3.04 g/mL(大劑量腦通湯組)，1.52 g/mL(中劑量腦通湯組)，0.76 g/mL(小劑量腦通湯組)。SD大鼠60只,隨機(jī)分為正常組和大、中、小劑量腦通湯組4組，每組15只。參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6]換算出灌胃給藥量,大、中、小劑量腦通湯組給藥量分別為15.2、7.6、3.8 g/(kg·d)，正常組灌服生理鹽水10 mL/(kg·d)，一天2次，連灌4 d；股動(dòng)脈采血, 3 000 r/min離心20 min,分離血清,過濾除菌，滅活，獲得正常血清及腦通湯大、中、小劑量含藥血清，-20 ℃凍存。

1.4BMECs的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定

參考文獻(xiàn)[8-12] 方法，稍作改良。選擇出生1周以內(nèi)SD大鼠，參照大鼠腦立體定位圖譜，剝離雙側(cè)大腦皮質(zhì)，于預(yù)冷D-Hanks液中將其剪碎成1 mm3大小組織塊，加入0.25%胰蛋白酶，消化15 min，滴加20% FBS培養(yǎng)基(含79% DMEM高糖培養(yǎng)基、20% FBS和1% 雙抗)終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，過篩目(先過100目，再過200目)，最后收集200目以上的細(xì)胞，在沉淀組織中滴加適量0.1% Ⅱ型膠原酶消化20 min，滴加20% FBS培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量20% FBS培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至2%明膠包被過的25 cm2培養(yǎng)瓶中。放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，隔2～3 d 換液1次。7～9 d后細(xì)胞呈現(xiàn)典型的單層“鋪路石”樣排列，用0.125%胰蛋白酶消化傳代，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色鑒定陽性，證明為BMECs。

1.5BMECs分組

取第2代BMECs隨機(jī)分為6組：正常組、缺氧-復(fù)氧模型組、正常血清組、大、中、小劑量腦通湯含藥血清組，后5組細(xì)胞均行缺血再灌注，后4組分別給予10%正常血清及10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清。10%正常血清或10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養(yǎng)基分別用89%的無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、1%雙抗和10%正常血清或10%腦通湯不同劑量含藥血清配制而成。

1.6BMECs缺氧/復(fù)氧模型的建立

參照文獻(xiàn)[13]的造模方法稍加改良，制備細(xì)胞缺氧24 h再復(fù)氧2 h模型：用無糖DMEM洗滌2次，缺氧前缺氧-復(fù)氧模型組、正常血清組、大、中、小劑量腦通湯含藥血清組加入10% FBS培養(yǎng)基、10% SD大鼠正常血清及10%腦通湯大、中、小劑量含藥血清培養(yǎng)基，置入37 ℃三氣培養(yǎng)箱,持續(xù)通入95% N2與5% CO2混合氣體，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h。再復(fù)氧時(shí)5組分別換液，培養(yǎng)基與缺氧前相同，放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱持續(xù)復(fù)氧2 h。對(duì)照組用10% FBS培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26 h，不做任何處理。

1.7MTT比色法測定BMECs的活性及存活率

取第二代的BMECs以5×105/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，造模后，吸棄96孔板各孔液體，每孔加四甲基偶氮唑藍(lán)磷酸緩沖液MTT(5 g/L)20 μL，混勻，37 ℃孵育4 h。棄上清液，每孔加100 μL的二甲基亞砜，均勻振蕩10 min，用酶標(biāo)儀(微量波長為570nm)處讀取吸光度值(OD值)，用OD值表示BMECs活性。細(xì)胞存活率以對(duì)照組OD值均數(shù)為100%，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=各孔OD值/對(duì)照組OD值均數(shù)×100%。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測BMECs的HIF-1α、VEGF、MMP-9mRNA的表達(dá)

HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA引物均由上海基爾頓生物科技有限公司設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)如下：HIF-1α mRNA上游引物5′ CAGCGATGACACGGAAAC 3′，下游引物5′ AGTGACTCTGGGCTTGAC 3′，擴(kuò)增長度210 bp；VEGFmRNA上游引物5′GAGTCTGTGCTCTGGGATTTG 3′，下游引物5′TCCTGCTACCTCTTTCCTCTG 3′，擴(kuò)增長度188 bp；MMP-9 mRNA上游引物5′ TCTCTACTGGGCATTAGGG 3′，下游引物5′ GTGTCCGAGGAAGATACTTG 3′，擴(kuò)增長度236 bp；β-catin mRNA上游引物： 5′ GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游：5′ TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，擴(kuò)增長度181 bp。用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用cDNA按照SYBR Green PCR 試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積25 μL，PCR 參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性，95 ℃，10 min，變性 95 ℃，15 s，退火60 ℃，45 s，延伸60 ℃，1 min，總共40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束時(shí)儀器自動(dòng)顯示達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)圈數(shù)(threshold cycles,CT)值。以內(nèi)參 β-actin mRNA的CT值標(biāo)化HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的 CT值，目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT方法計(jì)算[14]。公式如下：樣品目的基因ΔCT=樣品目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值；ΔΔCT =樣品目的基因ΔCT值-對(duì)照組ΔCT值。

1.9觀察指標(biāo)

倒置顯微鏡下觀察BMECs形態(tài)，第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定BMECs，比較各組BMECs的活性及存活率,觀察BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表達(dá)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1原代腦BMECs鑒定

A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B注： A為BMECs培養(yǎng)第5天，B為 BMECs培養(yǎng)第7天 圖1　原代BMECs 形態(tài)學(xué)觀察(×400)Fig.1　Morphological observation of primary BMECs

倒置顯微鏡下觀察BMECs形態(tài)：12 h大部分細(xì)胞貼壁，24后細(xì)胞伸出細(xì)小突起。培養(yǎng)4 d，細(xì)胞圍繞成“漩渦狀”；細(xì)胞繼續(xù)生長7～9 d后融合，呈現(xiàn)典型的“鵝卵石樣”密集的排列；細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)扁平梭形，椎體形，多角形，核卵圓形，可見核仁。第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定：熒光倒置顯微鏡下觀察,傳代細(xì)胞胞核周圍的胞漿內(nèi)均出現(xiàn)黃綠色熒光,即第Ⅷ因子抗原陽性,陽性率達(dá)95%,胞質(zhì)與胞核間界限明顯,證明細(xì)胞為BMECs。見圖1、2。

圖2　BMECs Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定(×400)Fig.2　Identification of factor VIII related antigen in BMECs by immunofluorescence

2.2BMECs的活性及存活率

缺氧24 h時(shí)模型組、腦通湯不同劑量含藥血清組、正常血清組的BMECs活性及存活率均較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，這5組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)氧2 h時(shí)5組BMECs活性及存活率仍均較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)，而腦通湯不同劑量含藥血清組較缺氧-復(fù)氧模型組明顯升高(P<0.05)，正常血清組較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)氧2 h時(shí)模型組、腦通湯不同劑量含藥血清組、正常血清組的BMECs的活性及存活率組內(nèi)比較均較缺氧時(shí)明顯升高(P<0.05)。見表1。

Tab.1　BMECs activity and the survival rate at 24 hours after hypoxia

分組BMECs缺氧24hBMECs活性(OD值)存活率(%)BMECs復(fù)氧2h活性(OD值)存活率(%)對(duì)照組0.748±0.0651000.748±0.065100缺氧-復(fù)氧模型組0.375±0.052(1)51.22±3.11(1)0.425±0.047(1)(3)62.38±4.45(1)(3)正常血清組0.388±0.052(1)52.38±4.02(1)0.438±0.051(3)63.27±4.57(3)腦通湯大劑量含藥血清組0.412±0.044(1)51.34±5.28(1)0.685±0.052(2)(3)82.75±7.41(2)(3)腦通湯中劑量含藥血清組0.405±0.039(1)53.22±5.42(1)0.638±0.048(2)(3)77.53±6.55(2)(3)腦通湯小劑量含藥血清組0.448±0.046(1)52.59±4.93(1)0.576±0.044(2)(3)61.05±5.34(2)(3)

(1)與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與同一時(shí)間點(diǎn)模型組比較，P<0.05，(3)與缺氧24 h比較，P<0.05

2.3BMECs中HIF-1α、VEGF、MMP-9mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:與正常細(xì)胞比較，模型組HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)。與模型組比較，腦通湯大、中、小劑量含藥血清組的HIF-1α、VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降趨勢，這3種基因的表達(dá)變化在腦通湯大、中劑量含藥血清組更為顯著(P<0.05)；正常血清組與模型組比較，HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表2。

3討論

BBB主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞足板等組成，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要天然屏障，也是血液循環(huán)重要物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到中樞的交通樞紐。BBB破壞是缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，研究顯示，在腦缺血再灌注損傷時(shí)，多種重要調(diào)控因子如HIF-1α、VEGF、MMP-9等參與并調(diào)控腦缺血再灌注BBB的結(jié)構(gòu)及功能的損傷[15-17]。HIF-1是存在人與哺乳動(dòng)物細(xì)胞低氧應(yīng)答反應(yīng)中的一種重要核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。其生物活性主要由α亞基所決定，HIF-1α的表達(dá)嚴(yán)格受到細(xì)胞氧濃度的調(diào)節(jié)[18]。HIF-1α既是調(diào)節(jié)亞基又是活性亞基，在缺血再灌注損傷下可誘導(dǎo)HIF-1α快速大量的表達(dá)[19]。而在缺氧時(shí)，HIF-1α在胞漿內(nèi)合成增加，可以對(duì)其下游基因，如MMPs、VEGF等基因進(jìn)行調(diào)控[20]。有研究證實(shí)，HIF-1α的表達(dá)與BBB通透性的改變息息相關(guān)[21]。因而，促進(jìn)HIF-1α表達(dá)是保護(hù)缺血再灌注損傷中BBB及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

注:A、B、C、D分別為 HIF-1α、VEGF和MMP-9及內(nèi)參 GAPDH mRNA 擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線圖3　HIF-1α、VEGF和MMP-9及內(nèi)參 GAPDH mRNA擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3　Amplified kinetic curves of HIF-1α,VEGF, MMP-9 and GAPDH mRNA

分組HIF-1αmRNA(2-ΔΔCT)VEGFmRNA(2-ΔΔCT)MMP-9mRNA(2-ΔΔCT)對(duì)照組0.293±0.0320.310±0.0400.334±0.025缺氧/復(fù)氧組模型組0.485±0.052(1)1.008±0.128(1)3.010±0.260(1)正常血清組0.748±0.041(2)1.372±0.363(2)0.943±0.148(2)腦通湯大劑量含藥血清組2.148±0.062(2)3.208±0.446(2)0.409±0.054(2)腦通湯中劑量含藥血清組1.847±0.032(2)2.669±0.265(2)0.582±0.081(2)腦通湯小劑量含藥血清組1.275±0.048(2)2.234±0.552(2)0.805±0.102(2)

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05

VEGF又稱血管通透性因子，在新生血管及損傷BBB通透性方面起著重要作用。生理狀態(tài)下，VEGF在腦內(nèi)僅有少量表達(dá)。在腦缺血再灌注損傷VEGF通過HIF-1α基因誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用，陶陶，陳懿等[21-22]研究證實(shí),在腦缺血再灌注中促進(jìn)VEGF高表達(dá)，或通過中藥復(fù)方干預(yù)提高HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而激活HIF-1α/VEGF通路，更進(jìn)一步促進(jìn)VEGF的表達(dá)，能達(dá)到保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)的重要成員，生理狀態(tài)下，MMP-9合成后以無活性的酶原的形式存在腦組織中，在腦缺血時(shí)MMP-9被激活，可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞BBB的完整性。研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9參與腦水腫的形成,改變BBB的通透性,與BBB結(jié)構(gòu)及功能的破壞密切相關(guān)[23-24]。祝美珍等[25]進(jìn)一步研究證實(shí)，通過中藥復(fù)方清熱化瘀Ⅱ號(hào)干預(yù)，下調(diào)腦缺血再灌注損傷MMP-9蛋白的表達(dá)，可以發(fā)揮腦保護(hù)作用。

腦通湯是況時(shí)祥教授通過長期臨床經(jīng)驗(yàn)累積針對(duì)VD早期的病理特征：脾氣虧虛，清陽不升，腦絡(luò)瘀阻，腦髓失養(yǎng)，兼肝陽浮越，加重腦部氣血瘀滯而研制出來的。方中黃芪補(bǔ)氣健脾，升清行血；水蛭活血通絡(luò)；輔以葛根，升清活血，天麻潛降浮陽，又可通絡(luò)，二藥共奏升清陽，降浮陽，調(diào)暢并運(yùn)行氣血精微上榮于腦的作用；佐以西洋參益氣養(yǎng)陰，健腦益智。諸藥合用，共奏補(bǔ)氣升陽，化瘀通絡(luò)，潛降浮陽之功。本課題前期臨床及實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5，26-28]，本方不僅可以改善VD早期患者認(rèn)知功能，改善VD大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力, 還可減少VD大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞及椎體細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用缺氧-復(fù)氧模型復(fù)制腦缺血再灌注BMECs損傷后，發(fā)現(xiàn)模型組的BMECs活性及存活率降低，而HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯升高；給予中藥復(fù)方腦通湯不同劑量含藥血清干預(yù)后，BMECs活性及存活率較模型組明顯升高，HIF-1α、VEGFmRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，而MMP-9 mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢。由此可見，在缺氧-復(fù)氧損傷后一方面HIF-1α基因高表達(dá)可以有效激活HIF-1α/VEGF通路，進(jìn)而促進(jìn)下游靶基因VEGF的表達(dá)；另一方面HIF-1α高表達(dá)可以誘導(dǎo)下游靶基因MMP-9的進(jìn)一步增高。給予腦通湯不同劑量含藥血清干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)本方可以進(jìn)一步有效的上調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α/VEGF通路的激活，繼續(xù)上調(diào)下游靶基因VEGF的表達(dá)；同時(shí)可顯著下調(diào)MMP-9基因表達(dá)，共同參與降低血腦屏障通透性。

概言之，腦通湯可以保護(hù)缺氧-復(fù)氧損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能與兩種途徑共同參與并介導(dǎo)降低BBB通透性有關(guān)，(1)上調(diào)HIF-1α mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α/VEGF通路的激活，增加VEGFmRNA的表達(dá)；(2)促進(jìn)HIF-1 αmRNA的高表達(dá)，進(jìn)而抑制下游靶基因MMP-9 mRNA的表達(dá)。

[1] 鄧振明.中風(fēng)癡呆病.中國醫(yī)藥學(xué)報(bào)， 1991(3)：13.

[2] 劉國政.缺血性腦血管病的研究進(jìn)展[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志， 2013(8)：5-6.

[3] 鄒偉，孫曉偉，于學(xué)平，等.血腦屏障與腦缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2009(3):466-468.

[4] 溫澤鋒.血腦屏障與血管性癡呆的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué).老年醫(yī)學(xué)分冊(cè)， 2007(5):211-215.

[5] 姜海鵬，況時(shí)祥.腦通膠囊治療血管性癡呆早期療效觀察[J].中國中醫(yī)急診， 2010(10):1669-1678.

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2005：203.

[7] 鄒移海，徐志偉，蘇鋼強(qiáng). 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京: 科學(xué)出版社， 2004:184.

[8] Ge S, Pachter JS. Isolation and culture of microvascular endothe-lial cells from murine spinal cord[J]. J Neuroimmunol, 2006(2):209-214.

[9] Calabria AR, Weidenfeller C, Jones AR, et al. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction [J].J Ne-urochem, 2006(4):922-933.

[10]Nakagawa S,Deli MA,Nakao S,et al.Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary culture of rat brain endothelial cells[J]. Cell Mol Neurobiol, 2007(6):687-694.

[11]吳秀芹,梅曉云,吳顥昕,等.大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011(3):187-189.

[12]王艷，汪寧，林辰雨.腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法概述[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2013(2):294-296.

[13]Zhang WD，Smith C，Shapiro A, et al. Increased expression of bioactive chemokines in human cerebromicrovascular endothelial cells and astrocytes subjected to simulated ischemia in vitro [J]. J Neuroimmunology, 1999 (2):148.

[14]Schmittgen TD, Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].Nature Protocols, 2008(3):1101-1108.

[15]張春麗,孟強(qiáng).缺血性腦血管病血腦屏障研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述, 2013(11):1935-1937.

[16]胡強(qiáng).缺氧誘導(dǎo)因子-1α在缺血缺氧腦損傷中的作用研究進(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志, 2013(3)：258-262.

[17]饒曉,湯軼波,潘彥舒,等.補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷血腦屏障的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志, 2014(6):49-52.

[18]Chandel NS,Budinger GR.The cellular basis for diverse response to oxygen [J]. Free Radic Biol Med, 2007(2):165-174.

[19]楊曉剛，朱慶華，常謹(jǐn)，等.缺氧誘導(dǎo)因子-1α在鼠肺缺血再灌注損傷中的表達(dá)與意義[J].中國循環(huán)雜志, 2012(6):466-469.

[20]鄒崢,劉小惠,鄒大衛(wèi).缺氧缺血性腦損傷[J].實(shí)用臨床兒科雜志, 2011(12):1446-1449.

[21]陶陶，陳莉芬，胡長林，等.大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF及VEGF mRNA的表達(dá)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005(2)：210-259.

[22]陳懿,朱惠斌,廖君,等.腦泰方對(duì)腦缺血再灌注大鼠 HIF-1α/VEGF的調(diào)節(jié)作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2014(10):1225-1230.

[23]何婭,胡春婷,陳松盛,等.大鼠腦缺血再灌注后MMP-9、MMP-2 表達(dá)與腦水腫的關(guān)系[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013(3):181-186.

[24]袁毅,雷立芳,涂秋云,等.大鼠腦缺血再灌注中血腦屏障通透性的改變基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)的關(guān)系[J].中國動(dòng)脈硬化雜志, 2008(7):510-512.

[25]祝美珍,蘇春壽,吳志敏,等.清熱化瘀Ⅱ號(hào)方對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2014(2):582-585.

[26]宋先紅，況時(shí)祥.腦通湯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡基因Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比例變化的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2014(11)：2567-2570.

[27]張樹森，況時(shí)祥，肖雁，等.腦通膠囊對(duì)VD大鼠海馬組織NMDA受體1亞基和2B亞基mRNA表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志, 2012(32)：79-82.

[28]張樹森，況時(shí)祥，肖雁，等. 腦通膠囊對(duì)VD大鼠海馬NMDA受體mRNA 表達(dá)及錐體細(xì)胞的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012(12)：230-235.

(2015-10-09收稿，2015-12-21修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 周凌

Study on Protective Effects of Naotong Soup on Brain Microvascular Endothelial Cell Injury Induced by Hypoxia-reoxygenation

HE Zhu1, KUANG Shixiang2, ZHANG Shuseng2, ZOU Jiali2

(1.ThirdPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550000,Guizhou,China； 2.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550003,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effects of Naotong soup on brain microvascular endothelial cell(BMECs) injury induced by hypoxia-reoxygenation and its mechanism. Methods: Primary rat BMECs were identified and passaged to the second generation. BMECs were divided into control group, normal serum group, hypoxia-reoxygenation model group, large, medium and small dose of Naotong soup medicinal serum group, BMECs in the later 5 groups were put into the three gas incubator for continuous infusion of mixture gas (95% N2 and 5% CO2) for 24 h and reoxygenation for 2 h to establish the model of cerebral ischemia and reperfusion. The activity and the survival rate of BMECs at 24 hours after hypoxia and 2 hours after reoxygenation were evaluated by MTT assay. Real-time fluorescent quantitative PCR was adopted to detect the relative expression levels of HIF-1α,VEGF and MMP-9 mRNA. Results: Compared with normal cell groups，BMECs activity and the survival rate of model groups was significantly lower after hypoxia for 24 h(P<0.05)in the later five groups, and there was no significant difference among the later 5 groups (P>0.05). Compared with model group, different dose of Naotong soup medicinal serum groups were significantly increased after reoxygenation for 2 h(P<0.05). The relative expression levels of HIF-1α, VEGF and MMP-9 mRNA increased in model group (P<0.05). Compared with the model group, the relative mRNA expression levels of HIF-1α and VEGF increased and MMP-9 mRNA decreased in Naotong soup medicinal serum groups, the changes were more significant in large, medium Naotong soup medicinal serum groups(P<0.05). However，there was no significant difference between normal serum group and model group (P>0.05). Conclusions: Naotong soup can protect BMECs after hypoxia -reoxygenation injury. Its mechanism may relate to up-regulate HIF-1α and VEGF mRNA levels and down-regulate MMP-9 levels.

[Key words]Naotong soup; ischemia and reperfusion; brain microvascular endothelial cells; blood-brain barrier; permeability

[中圖分類號(hào)]R743； R965

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)01-0017-07

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81160490)

**通信作者 E-mail:kuangshixiang2009@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1810.004.html