聚多巴胺球支撐銀納米粒子制備無(wú)酶過(guò)氧化氫生物傳感器

徐署東 李衛(wèi)東

(安徽省疾病預(yù)防控制中心 地方病與寄生蟲病防治科，合肥 230601)

聚多巴胺球支撐銀納米粒子制備無(wú)酶過(guò)氧化氫生物傳感器

徐署東 李衛(wèi)東

(安徽省疾病預(yù)防控制中心 地方病與寄生蟲病防治科，合肥 230601)

近年來(lái)，以聚多巴胺球支撐的納米復(fù)合材料越來(lái)越受到人們的關(guān)注。聚多巴胺球有表面功能化基團(tuán)如—OH、—NH2等，決定了聚多巴胺球可以充當(dāng)多種納米復(fù)合材料的活性載體。利用聚多巴胺良好的還原性制備并負(fù)載銀納米粒子于聚多巴胺球表面，制備出的新型復(fù)合材料銀納米粒子-聚多巴胺球(以下簡(jiǎn)寫為Ag@pdop)。Au修飾電極和銀納米粒子對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)均具有很好的催化性能，利用兩者特點(diǎn)將其復(fù)合制備修飾電極實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的無(wú)酶?jìng)鞲?，檢測(cè)靈敏度達(dá)到了14.7 μA/(mmol·L-1),檢出限可達(dá)11.8 μmol/L，線性范圍0.2～6.0 mmol/L，檢測(cè)結(jié)果及抗干擾能力均令人滿意。

聚多巴胺球；銀納米粒子；無(wú)酶?jìng)鞲衅?；過(guò)氧化氫

前言

多巴胺是一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，在植物體內(nèi)以多酚的前驅(qū)體形式存在。通過(guò)對(duì)生物表面膠黏性蛋白如貽貝類生物表面的結(jié)構(gòu)研究，多巴胺是很好的包覆材料。自聚后的聚多巴胺幾乎能在任何物質(zhì)表面附著，具有良好的生物相容性，同時(shí)具有產(chǎn)生條件簡(jiǎn)單、成膜快等特性。在具氧氣和弱堿性的溶液中，多巴胺及其它的兒茶酚胺都可自發(fā)進(jìn)行聚合反應(yīng)，該反應(yīng)現(xiàn)象為多巴胺溶液由無(wú)色被氧化成粉紅色，最終漸變?yōu)楹谏木酆衔铩?/p>

多巴胺表面有功能化的基團(tuán)如—OH、—NH2等，可以吸附多種金屬粒子以及金屬化合物。利用檸檬酸鈉的還原性可以將銀離子還原為銀納米粒子負(fù)載到聚多巴胺球上。成功地應(yīng)用于分析檢測(cè)過(guò)氧化氫(H2O2)。

生物機(jī)體內(nèi)眾多氧化酶反應(yīng)終產(chǎn)物或副產(chǎn)物是H2O2，因此實(shí)現(xiàn)其定量檢測(cè)，在生物、環(huán)境以及食品分析方面具有重要意義[1]。對(duì)于痕量H2O2的分析測(cè)定[2-6]，電化學(xué)法具有簡(jiǎn)單、快速和高效等優(yōu)點(diǎn)。而傳統(tǒng)的分析方法，如化學(xué)發(fā)光法[7]、分光光度法[8]以及光譜法[9]，因其樣品前處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易引入外來(lái)干擾物等原因，對(duì)實(shí)際生物樣品的檢測(cè)應(yīng)用受到很大的限制。電化學(xué)方法[10-12]具有快速、高效，前處理簡(jiǎn)單易于操作等特點(diǎn)。在電化學(xué)檢測(cè)H2O2方法中，固定活性酶的電化學(xué)傳感器得到廣泛的應(yīng)用，由于酶?jìng)鞲衅魅菀装l(fā)生酶的分解脫落、失活和儲(chǔ)存條件要求高受環(huán)境影響大等現(xiàn)象，極大地限制了其分析應(yīng)用。而無(wú)酶?jìng)鞲衅?，能有效地避免了酶基傳感器的諸多缺點(diǎn)，但多數(shù)無(wú)酶?jìng)鞲衅髟跍y(cè)定H2O2時(shí)應(yīng)用電壓比較高，樣品中共存易氧化的物質(zhì)可能會(huì)干擾分析測(cè)定。因此實(shí)現(xiàn)在較低電位下測(cè)定H2O2就顯得很重要。

納米材料由于其大的比表面積能有效增加傳感器的活性位點(diǎn)，使H2O2的氧化電位降低，電子傳遞得以促進(jìn)，提高了分析的響應(yīng)信號(hào)電流。銀納米粒子具有對(duì)H2O2還原良好的催化活性[13-14]。表現(xiàn)在還原H2O2時(shí)銀納米粒子修飾電極對(duì)其響應(yīng)的催化電流顯著增強(qiáng)。Welch等人也得出將銀納米粒子修飾在玻碳電極表面有利于H2O2的催化還原[15]。本方法成功合成復(fù)合材料銀納米粒子-聚多巴胺球(Ag@pdop)，并被引入到H2O2的無(wú)酶?jìng)鞲衅鞯闹苽渲?，?shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的分析測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(Hitachi-S4800S，F(xiàn)E-SEM，日本日立公司)，酸度計(jì)(pHS-3CT，上海大普儀器公司)，電子天平(FA2004，上海越平科學(xué)儀器公司)，PZ-1A真空干燥箱，磁力攪拌器(85-1，上海志威電器有限公司)，電化學(xué)工作站(CHI660C，中國(guó)上海辰華儀器公司)。

多巴胺(New Jersy公司)，Tris(上海生物化學(xué)試劑公司)，硝酸銀(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，異丙醇(北京百靈威科技有限公司)。檸檬酸三鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。H2O2(30%，北京化學(xué)試劑公司)，使用中現(xiàn)配現(xiàn)用稀過(guò)氧化氫溶液。

磷酸緩沖儲(chǔ)備溶液(PBS，0.1 mol/L)先用Na2HPO4和KH2PO4固體配制，其不同pH值系列溶液用NaOH(0.1 mol/L)和H3PO4調(diào)節(jié)得到。實(shí)驗(yàn)前所有的操作液通氮?dú)獬鯕?0 min并保持氮?dú)鈿夥铡?/p>

1.2 聚多巴胺球的合成

聚多巴胺球(pdop)是在水醇混合溶劑中合成的。稱取三(羥甲基)胺基甲烷0.062 1 g,并加入20 mL異丙醇,50 mL蒸餾水。稱取多巴胺0.075 g,加入上述的混合溶液中，混合溶液磁力攪拌3 d。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物的溶液離心并且用去離子水洗3次，真空干燥24 h，溫度設(shè)置為60 ℃。

1.3 聚多巴胺球上負(fù)載銀納米粒子復(fù)合材料的制備

將600 mg檸檬酸三鈉加入聚多巴胺球的懸浮液中。在磁力攪拌的條件下，分次加入AgNO3(20 mL，88 mg)溶液于聚多巴胺的懸浮液中，攪拌6 h。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物溶液離心水洗3次。真空干燥24 h,溫度設(shè)置為60 ℃。

1.4 制備修飾電極

預(yù)處理裸金電極，處理方法是依次在附有粒徑為0.3、0.1和0.05 μm的三氧化二鋁粉末的麂皮上對(duì)電極表面進(jìn)行拋光，然后分別在盛有丙酮和純水的超聲浴中清洗。將一定量的pdop和Ag@pdop溶液均勻滴涂在預(yù)處理并晾干后的金電極表面，室溫條件下自然晾干。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

應(yīng)用三電極體系開展電化學(xué)實(shí)驗(yàn)，參比電極為飽和甘汞電極，對(duì)電極為鉑絲電極，工作電極為裸金電極和相應(yīng)的修飾。以磷酸鹽緩沖底液(PBS，0.1 mol/L，pH=7.0)研究傳感器的電化學(xué)性能，且均在室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成材料的電鏡表征

對(duì)合成的pdop和復(fù)合材料Ag@pdop進(jìn)行了SEM表征。如圖1所示，圖1(A)表明聚多巴胺球已經(jīng)合成，微球直徑約500 nm，且球的大小均一。圖1(B)為聚多巴胺球上負(fù)載銀納米粒子，可以看出銀納米粒子已經(jīng)很好地負(fù)載到聚多巴胺球表面。表明檸檬酸鈉可以成功地將Ag離子還原成Ag納米粒子。

圖1 pdop(A)和Ag@pdop(B)的SEM圖Figure 1 SEM images of pdop (A) and Ag@pdop (B).

2.2 材料的XRD表征

圖2是聚多巴胺球和Ag@pdop的XRD表征圖?？梢钥吹骄鄱喟桶非驔]有明顯的XRD衍射峰。而Ag@pdop粉末制樣的四個(gè)XRD衍射峰(2θ角為：38.1°、44.3°、64.5°和77.4°)分別對(duì)應(yīng)于銀納米粒子的111、200、220和311四個(gè)晶面，這表明銀納米粒子被成功還原出來(lái)了。

圖2 Pdop(a)和Ag@pdop(b)的XRD圖Figure 2 XRD plots of pdop (a) and Ag@pdop (b).

2.3 修飾電極的電化學(xué)表征

用循環(huán)伏安法對(duì)三種材料制備的修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，如圖3所示，在濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，裸金電極與負(fù)載聚多巴胺的修飾電極均沒有出現(xiàn)明顯的氧化還原峰，這表明作為基體材料裸金電極和聚多巴胺本身是沒有電化學(xué)活性的。而Ag@pdop的修飾電極，可以看到有一對(duì)明顯的氧化還原峰出現(xiàn)，峰電位分別位于0和0.2 V處，這是銀納米粒子的氧化還原特征峰。表明Ag納米粒子已經(jīng)成功地負(fù)載到聚多巴胺球上。當(dāng)加入定量的H2O2于PBS底液中時(shí)，隨著H2O2的加入，相應(yīng)還原電流增加，-0.6 V處出現(xiàn)有明顯的峰電流，該實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合材料Ag@pdop在H2O2的還原過(guò)程中具有很好的催化能力。

圖3 PBS(0.1 mmol/L，pH=7.0)中四種不同的修飾電極的循環(huán)伏安圖Figure 3 Cyclic voltammograms of the four modified electrodes.

2.4 修飾電極對(duì)H2O2的電化學(xué)響應(yīng)

如圖4，隨著加入不同濃度的H2O2，Ag@pdop的修飾電極對(duì)H2O2的催化電流也逐漸增加。說(shuō)明H2O2對(duì)Ag納米粒子有很好的響應(yīng)。

圖4 Ag@pdop的修飾Au電極在PBS(pH=7)中，加入不同濃度的H2O2(0、1、2、3、4、5、6 mmol/L)的循環(huán)伏安圖Figure 4 Cyclic voltammograms of the Ag@pdop modified Au electrode in the 0.1mmol/L PBS (pH=7.0).

為研究修飾電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理，開展了在磷酸鹽(0.1 mol/L，pH=7.0)緩沖中Ag@pdop的修飾電極對(duì)H2O2的催化電流與掃速關(guān)系的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)。圖5(Ag@pdop Au電極在PBS(pH=7)和H2O2(5 mmol/L)中，插圖為掃描速率與峰電流的線性關(guān)系)是考察同種電極在20～200 mV/s范圍(從里到外依次為：20、40、60、80、100、120、140、160、180和200 mV/s)變換掃速得到的循環(huán)伏安曲線，結(jié)果表明隨著掃描速度的增加，相應(yīng)的電流也增大了，其中插入小圖給出了氧化峰電流與掃描速率之間存在的一次線性關(guān)系，其回歸方程為：ipa(μA)=18.4+0.008 19v，相關(guān)系數(shù)r=0.986 1，表明電極過(guò)程是受表面吸附控制的。

圖5 Ag@pdop Au電極不同掃描速率的循環(huán)伏安曲線Figure 5 Cyclic voltammograms of Ag@pdop Au electrode in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS with 5 mmol/L H2O2 at different scan rates.

用計(jì)時(shí)電流方法探究了H2O2在Ag@pdop修飾電極表面產(chǎn)生的響應(yīng)電流與H2O2濃度的關(guān)系。連續(xù)地向5 mL PBS底液(pH=7.0，0.1 mol/L)中加入H2O2，記錄安培電流值，如圖6所示(應(yīng)用電壓-0.4 V。插入小圖為Ag@pdop Au電極對(duì)濃度范圍為0.2～6.0 mmol/L的H2O2線性關(guān)系圖)。實(shí)驗(yàn)表明每加入一定量的H2O2，都會(huì)使還原電流相應(yīng)增加。計(jì)算得出該修飾電極對(duì)H2O2檢測(cè)靈敏度為14.7 μA/(mmol·L-1)，相關(guān)系數(shù)0.998，響應(yīng)時(shí)間小于5 s，3倍信噪比時(shí)，檢出限可達(dá)11.8 μmol/L，線性范圍0.2～6.0 mmol/L。數(shù)據(jù)處理顯示，催化電流大小與H2O2濃度有較好的線性關(guān)系。

圖6 Ag@pdop Au電極對(duì)不同濃度H2O2響應(yīng)的計(jì)時(shí)電流譜圖Figure 6 Spectrograms of Ag@pdop Au electrode at different concentrations of H2O2.

2.5 抗干擾實(shí)驗(yàn)

圖7 Ag@pdop Au電極對(duì)存在1.0 mmol/L AA,UA干擾實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)H2O2檢測(cè)響應(yīng)的計(jì)時(shí)電流譜圖Figure 7 A spectrogram of the Ag-Pdop Au electrode VS H2O2 in 1.0 mmol/L AA, UA) medium.

檢測(cè)實(shí)際樣品過(guò)程中，共存一些常見的電活性物質(zhì)諸如抗壞血酸(AsA)，尿酸(UA)等會(huì)對(duì)傳感信號(hào)產(chǎn)生干擾。如圖7所示，以0.1 mol/L pH7.0的PBS為底液，底液中加入1 mmol/L的H2O2產(chǎn)生的響應(yīng)計(jì)時(shí)電流后，依次加入干擾物質(zhì)AsA，UA各1 mmol/L，在該應(yīng)用電壓下，這些電活性物質(zhì)幾乎沒有產(chǎn)生干擾電流，稍后再次加入H2O2就又產(chǎn)生電流信號(hào)，實(shí)驗(yàn)表明該修飾電極制備的傳感器具備很好的抗干擾能力。

3 結(jié)語(yǔ)

利用銀納米粒子催化H2O2還原的還原能力，以及聚多巴胺球比表面大的特性，制備出基于Ag@pdop新型H2O2無(wú)酶?jìng)鞲衅?，具有很寬的檢測(cè)線性范圍，較高的靈敏度，并且可以很好地避免多種物質(zhì)的干擾。該修飾電極的應(yīng)用條件較簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)了對(duì)過(guò)氧化氫良好的快速選擇性檢測(cè)。這方面的工作可以為開發(fā)多種新型無(wú)酶?jìng)鞲衅鞯难芯刻峁┖芎玫姆椒ê退悸贰?/p>

[1] Xiao Y, Ju H X ,Chen H Y. Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase-labeled Au colloids immobilized on gold electrode surface by cysteamine monolayer[J].AnalyticaChimicaActa,1999,391(1):73-82.

[2] Zhou K, Zhu Y, Yang X, et al. A novel hydrogen peroxide biosensor based on Au-graphene-HRP-chitosan biocomposites[J].ElectrochimicaActa, 2010,55(9):3055-3060.

[3] 鄭龍珍,李引弟,熊樂艷,等.石墨烯-聚多巴胺納米復(fù)合材料制備過(guò)氧化氫生物傳感器[J].分析化學(xué)(ChineseJournalofAnalyticalChemistry),2012,40(1):72-76.

[4] 夏志,張宇,李黔柱,等.基于Hemin/多壁碳納米管納米復(fù)合物構(gòu)建的過(guò)氧化氫生物傳感器的研究[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué)(ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry),2014,4(2):74-78.

[5] You J M, Jeong Y N, Ahmed M S,et al.Reductive determination of hydrogen peroxide with MWCNTs-Pd nanoparticles on a modified glassy carbon electrode[J].BiosensorsandBioelectronics,2011,26(5):2287-2291.

[6] 陳志兵,查珺,宋倩,等.谷胱甘肽穩(wěn)定的CdTe量子點(diǎn)熒光猝滅法測(cè)定痕量過(guò)氧化氫[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué)(ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry),2012,2(2):10-13.

[7] Hanaoka S, Lin J M, Yamada M. Chemiluminescent flow sensor for H2O2based on the decomposition of H2O2catalyzed by cobalt(II)-etanolamine complex immobilized on rsein[J].AnalyticaChimicaActa,2001,426(1):57-64.

[8] Matsubara C, Kawamoto N, Takamura K. Oxo[5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porphyrinato]titaium(IV):an ultra-high sensitiyity[J].Analyst,1992(117):1781-1784.

[9] Li J, Tan S N, Ge H L.Silica sol-gel immobilized amperometric biosensor for hydrogen peroxide[J].AnalyticaChimicaActa, 1996,335(1-2):137-145.

[10] Garguilo M G, Huynh N, Proctor A,et al. Amperometric sensors for peroxide, choline, and acetylcholine based on electron transfer between horseradish peroxidase and a redox polymer[J].AnalyticalChemistry, 1993,65(5):523-528.

[11] Xiao Y, Ju H X, Chen H Y. A reagentless hydrogen peroxide sensor based on incorporation of horseradish peroxides in poly(thionine) film on a monolayer modified electrode[J].AnalyticaChimicaActa,1999,391(3): 299-306.

[12] Cui K, Song Y, Yao Y,et al. A novel hydrogen peroxide sensor based on Ag nanoparticles electrodeposited on DNA-networks modifed glassy carbon electrode[J].ElectrochemistryCommunications,2008,10(4):663-667.

[13] Kwok H N, Liu H, Penner R M. Subnanometer Silver Clusters Exhibiting Unexpected Electrochemical Metastability on Graphite[J].Langmuir, 2000,16(8):4016-4023.

[14] 徐署東.基于三種維度碳材料的電化學(xué)生物傳感器的制備和分析應(yīng)用[D]. 蕪湖:安徽師范大學(xué),2011:38-51.

[15] Welch C M, Banks C E, Simm A O,et al. Silver nanoparticle assemblies assemblies supported on glassy-carbon electrodes for the electro-analytical detection of hydrogen peroxide[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2005,382(1):12-21.

Preparation of Non-enzymatic H2O2Biosensor Based on Polydopamine Spheres Supported Ag Nanoparticles

XU Shudong, LI Weidong

(Dept.ofControlandPreventionofEndemic&ParasiticDiseases,AnhuiProvincialCenterforDiseasesControlandPrevention，Hefei,Anhui230601,China)

Poly dopamine spheres supported nano-composite materials have gained more and more attentions in recent years. The functional groups of the poly dopamine spheres, such as —OH, —NH2, etc., ensure that they can be the active carriers of a variety of nano-composite materials. Taking advantage of the good reduction preparation of poly (dopamine) as well as easy loading of silver nanoparticles on the surface of poly dopamine balls, a novel Ag nanoparticles-poly dopamine spheres (abbreviated Ag@pdop) composite was synthesized.The modified Au electrode and Ag nanoparticles both have good catalytic properties to hydrogen peroxide (H2O2) reduction reaction. Based on above characteristic of the Au electrode and Ag nanoparticles, a composite electrode were prepared which can be used as a non-enzymatic biosensor of H2O2.The detection sensitivity was 14.7 μA/(mmol·L-1).The detection limit was 11.8 μmol/L, and the linear ranges were 0.2-6.0 mmol/L. The test results and anti-interference abilities are satisfactory.

poly dopamine spheres; Ag nanoparticles; non-enzymatic biosensor; hydrogen peroxide

10.3969/j.issn.2095-1035.2016.04.020

2016-04-22

2016-05-23

徐署東，男，主管檢驗(yàn)師，主要從事理化檢驗(yàn)研究。E-mail：xushud@126.com

O657.1；TH832

A

2095-1035(2016)04-0079-05