新型診斷標(biāo)志物循環(huán)miRNA的研究進(jìn)展與應(yīng)用

何順偉綜述，魏曉星，2＊審校

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016 )

新型診斷標(biāo)志物循環(huán)miRNA的研究進(jìn)展與應(yīng)用

何順偉1綜述，魏曉星1，2＊審校

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016 )

循環(huán)miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的miRNA分子，具有差異表達(dá)明顯、檢測(cè)靈敏、取材方便等特點(diǎn)。循環(huán)miRNA可作為一種新型診斷標(biāo)志物分子，在癌癥預(yù)測(cè)、產(chǎn)前診斷、損傷及感染檢測(cè)等多個(gè)方面有臨床應(yīng)用前景。本文即對(duì)循環(huán)miRNA的來源和功能、診斷標(biāo)志物潛能及臨床應(yīng)用前景等方面的研究進(jìn)展作一綜述，并對(duì)目前應(yīng)用中 存在的相關(guān)問題進(jìn)行探討。

1 循環(huán)miRNA概述

MiRNA是一類長(zhǎng)度約為18-24 nt左右的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，它與mRNA的3′ UTR互補(bǔ)結(jié)合致mRNA直接降解或抑制其翻譯而干擾蛋白質(zhì)的合成，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。自1993年被發(fā)現(xiàn)以來[1]，miRNA獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和功能成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)，開辟了分子生物學(xué)研究的一個(gè)新領(lǐng)域。

miRNA在進(jìn)化上具有極高的保守性、時(shí)序性、組織特異性及穩(wěn)定性等特點(diǎn)。研究表明在血清、血漿等體液中能夠檢測(cè)到穩(wěn)定存在的miRNA，即循環(huán)miRNA[2，3]。循環(huán)miRNA在不同生理病理?xiàng)l件下表達(dá)水平差異明顯，與個(gè)體的健康水平密切相關(guān)[4～6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，循環(huán)miRNA的檢測(cè)手段日漸趨于成熟，靈敏度高且操作損傷小，有廣闊臨床應(yīng)用前景。

2 循環(huán)miRNA的來源和功能

2.1 細(xì)胞內(nèi)miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)miRNA的產(chǎn)生過程同蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄過程十分相似。首先，miRNA基因在RNA聚合酶II或III作用下轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA長(zhǎng)度從200 nt到數(shù)千nt不等，經(jīng)修飾加工后形成含有5′ cap和3′ poly A尾的特征性發(fā)卡結(jié)構(gòu)。然后，pri-miRNA被Drosha-DGCR8復(fù)合體切割成約70 nt的發(fā)卡狀miRNA前體(pre-miRNA)，繼而經(jīng)exportin-5等蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。最后，pre-miRNA被Dicer酶剪切成約22 nt的miRNA： miRNA*雙鏈，其中一條成熟的單鏈miRNA與Argonaute蛋白等結(jié)合被引導(dǎo)進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)中，另一條單鏈miRNA*被降解(圖1)。

成熟的單鏈miRNA經(jīng)堿基互補(bǔ)靶向結(jié)合到mRNA的3′ UTR，通過直接降解mRNA或抑制其翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)。資料顯示[7]，miRNA與其靶基因mRNA的堿基互補(bǔ)程度將決定mRNA是降解還是抑制：當(dāng)二者完全互補(bǔ)時(shí)直接降解mRNA，多發(fā)于植物中；當(dāng)二者不完全互補(bǔ)時(shí)將抑制靶基因蛋白翻譯，多發(fā)于動(dòng)物中。作為一種表達(dá)調(diào)控因子，miRNA能夠靶向調(diào)控大約60%的蛋白編碼基因[8]，且在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫、炎癥等多種生理病理調(diào)控過程中起核心作用[9]。miRNA異常表達(dá)、加工或突變同樣會(huì)使與之相關(guān)的靶基因活性改變而影響正常的基因功能，進(jìn)而造成癌癥、心臟病、糖尿病等多種疾病發(fā)生[10]。miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制如圖1所示。

2.2 循環(huán)miRNA的來源和功能

關(guān)于循環(huán)miRNA的來源存在較大爭(zhēng)議，目前主要有兩種觀點(diǎn)。第一，miRNA從受損或凋亡的細(xì)胞中被動(dòng)滲出進(jìn)入體液循環(huán)，如miRNA-208在心臟中特異性表達(dá)，當(dāng)發(fā)生心肌梗死時(shí)可在血漿中檢測(cè)到[11]。第二，miRNA通過兩種方式主動(dòng)分泌進(jìn)入體液循環(huán)(圖1)，一種是與高密度脂蛋白(HDL)、核酸蛋白1(NPM1)以及家族蛋白2(Ago2)等特異結(jié)合分泌至細(xì)胞外；另一種則是miRNA被包裝在微體(microvesicle)或外來體(exosomes)等活性囊泡中分泌至細(xì)胞外。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[12]，miRNA的分泌需要神經(jīng)酰胺的參與，而神經(jīng)酰胺的合成受到神經(jīng)磷脂酶2(nSMase2)控制。

Pol II：RNA聚合酶；Drosha/DGCR8：RNase III酶；Exportin-5：蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體；Dicer：剪切酶；Pri-miRNA：初級(jí)miRNA；Pre-miRNA：前體miRNA；RISC：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；exosomes：活性囊泡；Ceramide：神經(jīng)酰胺

圖1 miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制示意圖

Figure 1 Biogenesis and mechanism of miRNA

對(duì)循環(huán)miRNA的功能研究尚處于起步階段，其中最引人注目的就是循環(huán)miRNA參與細(xì)胞間的信息交流。即miRNA可從某一細(xì)胞產(chǎn)生、釋放至體液后被另一細(xì)胞識(shí)別、攝取和利用，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信息交流。Zhang等發(fā)現(xiàn)[13]，微血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞-1能夠攝取體內(nèi)血細(xì)胞或體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞分泌的循環(huán)miRNA-150調(diào)節(jié)原癌基因c-Myb的表達(dá)。Pegtel等[14]通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)B細(xì)胞感染EB病毒后分泌的miRNA，可被外周血單核細(xì)胞攝取并抑制相應(yīng)的EB靶基因表達(dá)。此外，循環(huán)miRNA還被發(fā)現(xiàn)具備一些特殊功能，如調(diào)控腫瘤發(fā)生和免疫反應(yīng)，參與造血和細(xì)胞分化等。

3 循環(huán)miRNA的診斷標(biāo)志物潛能

由于傳統(tǒng)蛋白類生物標(biāo)志物成分復(fù)雜，存在翻譯后修飾及低靈敏度、低豐度和低特異性等不足，限制了其臨床應(yīng)用。近年人們發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA具備穩(wěn)定性好、表達(dá)差異明顯、檢測(cè)靈敏以及能及時(shí)反映人體狀況等特征，是一類潛在的新型診斷標(biāo)志物分子。

3.1 循環(huán)miRNA的穩(wěn)定性

鑒于體液中含有豐富的RNase，所以學(xué)界普遍認(rèn)為體液中的miRNA是極不穩(wěn)定的。而有研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA在RNase作用、多次凍融、煮沸、極端pH和溫度等狀況下并未發(fā)生顯著性變化[3]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，循環(huán)miRNA大多不是以游離形式存在的，而是與特殊蛋白結(jié)合[15]或包裹在活性囊泡中[16]以復(fù)合體的形式存在于體液中，因而具備了抗RNase降解的能力，能夠穩(wěn)定保存。這一特性為循環(huán)miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能提供了前提保證，也為其作為生物標(biāo)志物提供了可能。

3.2 循環(huán)miRNA的表達(dá)差異

循環(huán)miRNA已被多次證實(shí)在不同生理病理?xiàng)l件下具有明顯的表達(dá)差異，與個(gè)體的生理病理狀態(tài)密切相關(guān)。例如，Gilad等[17]對(duì)比懷孕婦女與未孕婦女血清的miRNA發(fā)現(xiàn)，血清miR-526a和miR-527在孕期顯著表達(dá)并隨著妊娠周數(shù)增加而升高。并且Chim等[18]實(shí)驗(yàn)顯示，血漿miRNA-141和miRNA-149在孕婦產(chǎn)后表達(dá)水平顯著性下降。此外，不同健康個(gè)體的循環(huán)miRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，而疾病能夠明顯影響循環(huán)miRNA的表達(dá)，并且隨病情進(jìn)展其表達(dá)譜呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。如循環(huán)miR-122在肝臟病變中顯著表達(dá)[4]，循環(huán)miR-125在肺部病變中顯著表達(dá)[5]，循環(huán)miR-483在胰腺病變中顯著表達(dá)[6]。這些差異表達(dá)的循環(huán)miRNA既是其功能研究的基礎(chǔ)，又是潛在的診斷標(biāo)志物分子。

3.3 循環(huán)miRNA的檢測(cè)方法

由于循環(huán)miRNA片段小、表達(dá)量低，使其定量檢測(cè)受到限制。盡管如此，近年來仍發(fā)展了多種有效的循環(huán)miRNA檢測(cè)方法[19，20]，不僅包括傳統(tǒng)的cDNA文庫(kù)克隆法和Northern blot、qRT-PCR法，還包括新近發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)。其中cDNA文庫(kù)克隆法是發(fā)現(xiàn)新miRNA分子的首選方法，大部分已知的miRNA都是通過cDNA文庫(kù)克隆發(fā)現(xiàn)和鑒定的。Northern blot法是驗(yàn)證和確認(rèn)循環(huán)miRNA的重要方法。qRT-PCR法是循環(huán)miRNA定量檢測(cè)最常用的有效方法，可以精確地定量分析樣本中微量miRNA的表達(dá)?；蛐酒夹g(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量的miRNA表達(dá)分析。高通量測(cè)序技術(shù)是目前最具前景的檢測(cè)循環(huán)miRNA的技術(shù)，可以用于檢測(cè)miRNA組織特異性和時(shí)序特異性表達(dá)。我們可以根據(jù)自己的研究目的選擇適合的檢測(cè)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，循環(huán)miRNA的檢測(cè)手段又有了新的改進(jìn)和發(fā)展，如鎖核酸(LNA)探針法、Stem loop RT-PCR法、納米金標(biāo)記法和滾環(huán)擴(kuò)增法等[21]使循環(huán)miRNA的檢測(cè)具有更高的靈敏度和精確度，為其成為診斷標(biāo)志物提供技術(shù)支持。

4 循環(huán)miRNA的應(yīng)用前景

4.1 循環(huán)miRNA作為癌癥標(biāo)志物

循環(huán)miRNA的表達(dá)水平與癌癥的發(fā)生和演進(jìn)密切相關(guān)，具備類似致癌基因或抑癌基因的作用，并且不同癌癥類型具有特定的表達(dá)譜。最早由Lawri等[22]報(bào)道，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血清中miRNA-155、miRNA-210和miRNA-21表達(dá)水平較正常對(duì)照明顯升高，可作為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷標(biāo)志物。之后關(guān)于循環(huán)miRNA作為結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、白血病等癌癥標(biāo)志物的研究屢見報(bào)道。對(duì)循環(huán)miRNA作為癌癥標(biāo)志物的相關(guān)研究進(jìn)行如下總結(jié)(表1)。

表1 循環(huán)miRNA作為癌癥標(biāo)志物

Table 1 Circulating miRNA as diagnostic markers for different human cancer

注：“↑”：miRNA表達(dá)上調(diào)；“↓”：miRNA表達(dá)下調(diào).

4.2 循環(huán)miRNA作為產(chǎn)前診斷標(biāo)志物

目前，產(chǎn)前診斷通常依靠侵入性檢測(cè)手段，風(fēng)險(xiǎn)較高，母體血漿中miRNA的發(fā)現(xiàn)為非侵入性的產(chǎn)前診斷開創(chuàng)了可能，并且穩(wěn)定性好、特異度高。近年來，Zahm等[29]證實(shí)，循環(huán)miR-200b/429水平可作為嬰兒膽道閉鎖的診斷指標(biāo)。Zhu等[30]通過Solid測(cè)序和qRT-PCR等證實(shí)，miRNA-196、miRNA-22、miRNA-29c和miR-375在行孕期先天性心臟病檢測(cè)的孕婦的血清中表達(dá)上調(diào)，可作為產(chǎn)前先天性心臟病的診斷指標(biāo)。Lalevee等[31]證實(shí)，在先兆子癇孕婦胎盤中miR-455-3p和miR455-5p表達(dá)顯著性下調(diào)，在孕婦血液中檢測(cè)到miR-455，表明循環(huán)miR-455可作為孕婦先兆子癇的診斷指標(biāo)。

4.3 循環(huán)miRNA作為損傷標(biāo)志物

循環(huán)miRNA-122已證實(shí)在藥物、病毒、酒精和化學(xué)誘導(dǎo)的肝損傷中表達(dá)上調(diào)。Huang[4]等在膽道梗阻誘導(dǎo)的膽汁淤積肝損傷的小鼠中發(fā)現(xiàn)血清miRNA-122表達(dá)顯著升高。因此，循環(huán)miRNA-122具有肝損傷診斷價(jià)值。另外，在急性腎缺血損傷的小鼠血漿中miR-714、miR-1188、miR-1897-3p、miR-877*和miR-1224的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，且miR-1897-3p和Nucks1基因表達(dá)緊密相關(guān)[32]。急性脊髓損傷的小鼠血漿中miR-219、miR-384-5p和miR-9*在損傷12 h后表達(dá)水平顯著升高，并同損傷程度相關(guān)[33]。這些結(jié)果表明，循環(huán)miRNA具備作為組織損傷診斷標(biāo)志物的潛能。

4.4 循環(huán)miRNA作為感染標(biāo)志物

循環(huán)miRNA在感染性疾病宿主和病原體的相互作用過程中發(fā)揮重要作用，在病原體感染進(jìn)程中循環(huán)miRNA表達(dá)譜呈現(xiàn)特征性改變，可以作為篩選和診斷感染性疾病的標(biāo)志物。如HBV病人肝纖維化病變過程中有12種血漿miRNA差異表達(dá)明顯，其中10個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)[34]。HCV患者血漿miRNA中miR-122、miR-134、miR-424-3p和miR-629-5p表達(dá)明顯上調(diào)[35]。Morán等[36]研究甲型H1N1流感病毒A(A/H1N1)輕、重型患者及同居者和健康者的循環(huán)miRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-150、miR-29c、miR-145、miR-22和miR-150在重型患者中呈差異性表達(dá)，其中miR-150較輕型患者顯著性過表達(dá)，而miR-210、miR-126和miR-222在同居者中表達(dá)水平下降。

5 存在問題及展望

開發(fā)循環(huán)miRNA作為診斷標(biāo)記物具有重要的理論和實(shí)踐意義，但目前仍然存在以下幾個(gè)問題需要我們?nèi)ソ鉀Q。1、體液miRNA濃度低分離提取繁瑣，費(fèi)用高，加上可能存在mRNA降解或其他小RNA的干擾，使獲取的miRNA的質(zhì)量難以保證。2、缺乏統(tǒng)一準(zhǔn)確的循環(huán)miRNA檢測(cè)方法，目前不同檢測(cè)miRNA的手段都存在各自的局限，如對(duì)于部分豐度較低且具有組織和時(shí)序特異性的miRNA分子而言，很難構(gòu)建其cDNA文庫(kù)；Northern blot方法繁瑣并且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果很大程度上依賴于引物和探針的設(shè)計(jì)；基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較差，要求初始樣本量大；高通量測(cè)序技術(shù)價(jià)格昂貴且操作費(fèi)時(shí)。3、目前對(duì)循環(huán)miRNA作為診斷標(biāo)志物的研究尚處于探索階段，研究的病種還不全面，所檢測(cè)的病例數(shù)也有限，篩選出的可能作為診斷標(biāo)志物的循環(huán) miRNA的靈敏性和特異性尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。4、最重要的是循環(huán)miRNA的產(chǎn)生和作用機(jī)制仍不清楚，不同生理病理?xiàng)l件下循環(huán)miRNA參考值范圍尚未確定。

對(duì)循環(huán)miRNA的研究已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，可以預(yù)期這種趨勢(shì)將繼續(xù)延續(xù)。循環(huán)miRNA作為診斷標(biāo)志物，將改變和補(bǔ)充對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，同時(shí)整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)等相關(guān)研究的知識(shí)，從全方位闡明多種疾病產(chǎn)生和發(fā)展的分子機(jī)制，使疾病檢測(cè)手段更加豐富和有效。相信隨著循環(huán)miRNA生成機(jī)理、生物學(xué)功能以及檢測(cè)手段逐步被闡明和標(biāo)準(zhǔn)化，其在未來的無創(chuàng)診斷中將展示出廣闊的應(yīng)用前景。

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*：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260015) 何順偉(1988～)，女，漢族，河南信陽(yáng)，在讀碩士研究生

R446.11

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.012

2015-11-11

*通訊作者：魏曉星，副教授，研究生導(dǎo)師，Email： weixiaoxing@tsinghua.org.cn