王文鋒穆靈敏張采宏井長(zhǎng)勤*高啟禹*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南新鄉(xiāng) 453003）

生物技術(shù)專業(yè)基因工程大實(shí)驗(yàn)的探索和優(yōu)化

王文鋒1穆靈敏2張采宏1井長(zhǎng)勤1*高啟禹1*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 河南新鄉(xiāng) 453003）

基因工程是生物技術(shù)專業(yè)的一門核心課程，尤其是基因工程大實(shí)驗(yàn)，學(xué)生對(duì)其的掌握程度對(duì)他們今后工作以及科研影響很大。為提高教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)效果，本文從教學(xué)方法、教學(xué)內(nèi)容等方面對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化整合，設(shè)計(jì)了一個(gè)α-淀粉酶基因蛋白的原核表達(dá)及純化實(shí)驗(yàn)，將逐個(gè)單一技術(shù)通過(guò)一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來(lái)，成為一個(gè)有機(jī)整體，最終讓學(xué)生對(duì)微妙的分子操作能夠感應(yīng)的到，取得了很好的效果。

生物技術(shù) α-淀粉酶 基因工程大實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌

基因工程要求較強(qiáng)的實(shí)踐性,要求從事此操作的專業(yè)技術(shù)人員不僅要有深厚的理論基礎(chǔ),還要具有較強(qiáng)的動(dòng)手能力?；蚬こ檀髮?shí)驗(yàn)主要包括目的基因的擴(kuò)增、反應(yīng)產(chǎn)物的回收、目的基因的連接及轉(zhuǎn)化等,這一系列完整的實(shí)驗(yàn)操作可以很好地鍛煉和提升學(xué)生的動(dòng)手能力,對(duì)實(shí)驗(yàn)的整體把握力和問(wèn)題的處理分析能力［1］。如果能設(shè)計(jì)一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)將上述基因工程的操作串聯(lián)起來(lái),讓學(xué)生親自操作整個(gè)過(guò)程并解決其中出現(xiàn)的問(wèn)題,將對(duì)學(xué)生掌握這門課起到了一個(gè)很好的作用。

α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于低聚糖、啤酒及面制品等的生產(chǎn),具有十分廣闊的市場(chǎng)前景。最主要的是,α-淀粉酶在基因工程方面應(yīng)用的比較廣泛［2］,如能夠催化α-1,4-葡萄糖多聚體的水解,是一種非常重要的內(nèi)生淀粉酶；通過(guò)測(cè)定酶的活力,SDS-PAGE分析判斷基因表達(dá)的強(qiáng)弱；通過(guò)強(qiáng)化啟動(dòng)子功能,提高分子拷貝數(shù)提高淀粉酶的分泌能力等［3,4］。鑒于α-淀粉酶在基因工程中的廣泛應(yīng)用,本實(shí)驗(yàn)改革設(shè)計(jì)了“α-淀粉酶基因的原核表達(dá)及純化”實(shí)驗(yàn),將逐個(gè)單一技術(shù)通過(guò)一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來(lái),成為一個(gè)有機(jī)整體。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn),學(xué)生可獲得一個(gè)肉眼可見(jiàn)的基因工程產(chǎn)物即淀粉透明圈,使微觀的分子世界通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)變得明朗起來(lái),讓初次學(xué)習(xí)基因工程的同學(xué)獲得較強(qiáng)的學(xué)習(xí)興趣,以達(dá)到最好的教學(xué)效果。

1 改革教學(xué)內(nèi)容的目的

讓學(xué)生學(xué)會(huì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本方法和原理是實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主要目的,因此實(shí)驗(yàn)教學(xué)應(yīng)該在老師的指導(dǎo)下給學(xué)生以盡可能多的獨(dú)立操作?；蚬こ淌且婚T實(shí)踐性極強(qiáng)的課程,通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué),不僅要讓學(xué)生更好地掌握所學(xué)知識(shí),同時(shí)也要培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力［5］。因此,激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維、創(chuàng)新和實(shí)踐能力是基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)不斷努力和探索的方向。以前的實(shí)驗(yàn)課存在這樣的弊病,如基本內(nèi)容雖然包括了PCR、質(zhì)粒提取、感受態(tài)制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等最基本的實(shí)驗(yàn)操作,開(kāi)設(shè)內(nèi)容也達(dá)到了培養(yǎng)生物技術(shù)相關(guān)人才的基本要求,但每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)時(shí)間短且分散的,相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容連貫不強(qiáng),加上分子水平操作的枯燥及目標(biāo)產(chǎn)物不可見(jiàn)性,導(dǎo)致學(xué)生雖然實(shí)驗(yàn)之初興趣頗高,實(shí)驗(yàn)最后卻不能有效地將相關(guān)實(shí)驗(yàn)銜接,最終導(dǎo)致興趣缺乏。所以有必要對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革、重置為綜合性實(shí)驗(yàn),用一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容將上述技術(shù)串聯(lián)起來(lái)。

2 改革后的教學(xué)內(nèi)容

①?gòu)幕蛭膸?kù)中找到基因序列,設(shè)計(jì)引物,兩端加上HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn) ,從菌株DNA中PCR擴(kuò)增得到兩端加有酶切接頭的產(chǎn)物,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)——學(xué)習(xí)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。② PCR產(chǎn)物的回收后,用限制性內(nèi)切酶雙酶切目的基因和載體——學(xué)習(xí)酶切和DNA回收技術(shù)。③目的基因與表達(dá)載體的連接——學(xué)習(xí)DNA重組技術(shù)。④制備感受態(tài)細(xì)胞,重組子轉(zhuǎn)化——學(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化技術(shù)。⑤重組子的篩選——綜合技術(shù)的重溫。⑥蛋白表達(dá)及純化——學(xué)習(xí)蛋白表達(dá)技術(shù)。⑦實(shí)驗(yàn)論文的完成。

3 改革教學(xué)內(nèi)容的結(jié)果

通過(guò)探索從克隆一個(gè)基因（α-淀粉酶）到最終表達(dá)出該基因產(chǎn)物的整個(gè)過(guò)程,學(xué)生最終可獲得一個(gè)肉眼可見(jiàn)的基因工程產(chǎn)物——淀粉透明圈,既提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,也取得到了很好的學(xué)習(xí)效果,對(duì)基因工程的操作有了一個(gè)全面的掌握。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)改革首先規(guī)范化了α-淀粉酶基因的原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟,使之成為一個(gè)學(xué)生可操作的成熟的綜合性基因工程大實(shí)驗(yàn)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn),改革了以前通過(guò)多個(gè)單一實(shí)驗(yàn)使學(xué)生逐項(xiàng)掌握單個(gè)技術(shù)為目的,將逐個(gè)單一技術(shù)通過(guò)一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來(lái),成為一個(gè)有機(jī)整體。通過(guò)實(shí)驗(yàn),不僅使學(xué)生掌握了基因工程核心要素“目的基因克隆、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及篩選”等過(guò)程,同時(shí)也使學(xué)生學(xué)會(huì)了質(zhì)粒提取、DNA瓊脂糖凝膠電泳以及蛋白表達(dá)和純化等實(shí)驗(yàn)技術(shù),將以前支離破碎的多個(gè)單一實(shí)驗(yàn)環(huán)環(huán)相扣成為了一個(gè)整體［6］。通過(guò)此次實(shí)驗(yàn),學(xué)生可獲得一個(gè)肉眼可見(jiàn)的基因工程產(chǎn)物即淀粉透明圈,另外, α-淀粉酶基因是從真核生物中首先克隆出來(lái)的基因,能夠通過(guò)原核表達(dá)獲得其活性產(chǎn)物,使學(xué)生更直觀的認(rèn)識(shí)到了基因工程可以跨越物種障礙,感受到基因工程的獨(dú)特魅力,大大提高了學(xué)生對(duì)基因工程實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)興趣,取得到了很好的教學(xué)效果。

另外,筆者在實(shí)驗(yàn)結(jié)束安排學(xué)生嘗試以“α-淀粉酶基因的克隆和表達(dá)”為題,寫一篇關(guān)于來(lái)源于α-淀粉酶基因在大腸桿菌中得到表達(dá)的實(shí)驗(yàn)論文。通過(guò)查閱相關(guān)的參考文獻(xiàn),可以進(jìn)一步擴(kuò)大學(xué)生的知識(shí)面,既有利于學(xué)生很好地復(fù)習(xí)實(shí)驗(yàn)課所學(xué)的知識(shí),又可以盡早地熟悉論文的書(shū)寫格式,為以后的工作和科研做準(zhǔn)備。

［1］何艷，張婷，吳昌學(xué)，等.醫(yī)學(xué)生物技術(shù)本科生基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)與實(shí)踐［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生2013，29（11）：1735-1736.

［2］馮樂(lè)平，劉志國(guó)，王文鋒，等.基因工程實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：科學(xué)出版社，2013：54-57.

［3］黃春敏，沈微，王正祥.高溫α-淀粉酶高表達(dá)的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2010， 30（5）：36-42.

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Q-3

A

1674-2060（2016）03-0254-01