許玉燦

（濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 山東濟(jì)南 250200）

有機(jī)鋅的富集載體及檢測(cè)方法綜述

許玉燦

（濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 山東濟(jì)南 250200）

有機(jī)鋅在化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)效價(jià)、使用效果及保護(hù)環(huán)境等方面都優(yōu)于無(wú)機(jī)鋅，通過(guò)富集轉(zhuǎn)化可以將無(wú)機(jī)鋅轉(zhuǎn)變成有機(jī)鋅。在富集轉(zhuǎn)化的研究中，富集載體的選擇，檢測(cè)方法的使用都是極為關(guān)鍵的。本文對(duì)有機(jī)鋅的富集載體、檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)和比較。

有機(jī)鋅 富集載體 檢測(cè)方法

前言

鋅是人體必需的微量元素,參與動(dòng)物體內(nèi)300余種酶和功能蛋白的組成［1］。鋅不僅能夠維持生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［2］,還與胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素、前列腺素及其他激素的合成與代謝有關(guān)。

有機(jī)鋅是動(dòng)物吸收鋅離子的主要形式,又是動(dòng)物體內(nèi)合成蛋白物質(zhì)的中間產(chǎn)物。有機(jī)態(tài)鋅元素的獲得,目前主要有兩個(gè)途徑：一是人工合成；二是生物富集。

用生物的方法富集人和動(dòng)物所必需的微量元素,日益受到人們的青睞,目前已經(jīng)成為微量元素研究和產(chǎn)品開發(fā)的主流。利用生物富集轉(zhuǎn)化有機(jī)鋅,價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、具有功能性并且應(yīng)用廣泛,所以生物鋅的需求量極大。

1 有機(jī)鋅的分類及常用有機(jī)鋅

有機(jī)微量元素絡(luò)（螯）合物一般可以分為兩大類：有機(jī)酸鋅鹽和氨基酸螯合鋅。

有機(jī)酸鋅鹽：主要有葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅、乳酸鋅和丙酸鋅等,由于成本問(wèn)題,一些簡(jiǎn)單的有機(jī)酸鋅鹽使用較為廣泛,被認(rèn)為是第二代飼料添加劑。

氨基酸螯合鋅：螯合鋅中與中心離子鋅配位的叫配位體,配位體可以是單個(gè)氨基酸（如蛋氨酸、甘氨酸等）,也可以是復(fù)合氨基酸。

2 有機(jī)鋅的優(yōu)點(diǎn)

2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 無(wú)機(jī)態(tài)的鋅僅僅是陰陽(yáng)離子間形成離子鍵結(jié)構(gòu),易解潮且易與維生素發(fā)生拮抗作用［3］。有機(jī)鋅中的螯合鋅離子鍵與配位鍵共存［4］,且離子不易與其他物質(zhì)結(jié)合成不溶性化合物或被吸附在不溶性膠體上,具有良好的生物和化學(xué)穩(wěn)定。

2.2 生物學(xué)效價(jià)高 無(wú)機(jī)鋅離子容易與植酸、脂肪、纖維等不溶性成分結(jié)合直接隨糞便排出體外而不能被機(jī)體吸收［5］。Midill等［6］通過(guò)在肉雞飼糧中加入植酸酶可提高無(wú)機(jī)鋅的利用率, 證實(shí)了腸道中植酸等不溶性成分會(huì)絡(luò)合鋅離子影響其吸收這一觀點(diǎn)。

有機(jī)酸鋅鹽則使得鋅的吸收率大大提高,但對(duì)腸胃有刺激作用。氨基酸微量元素鰲合物（AA TMC）可以利用氨基酸和小肽的吸收通道［7］,完整地通過(guò)小腸黏膜進(jìn)入血漿, 減少了許多生化反應(yīng),因此吸收快,生物利用率高。但也有研究認(rèn)為有機(jī)鋅和無(wú)機(jī)鋅在一定情況下沒有顯著差別［8］。

2.3增強(qiáng)免疫力,提高抗病、抗氧化能力 有機(jī)鋅具有增強(qiáng)抗菌能力、提高免疫應(yīng)答反應(yīng)、促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞和體液免疫力的功效［9］,還具有抗氧化功能［3］。

2.4保護(hù)環(huán)境,減少重金屬污染 在橡膠中普通氧化鋅重金屬鋅含量約為80 %, 而有機(jī)鋅鋅含量可降低到40%或更低［10］,趨近于環(huán)保型綠色橡膠助劑［11］。有機(jī)鋅還可以降低養(yǎng)殖業(yè)中的鋅污染［12］。

3 有機(jī)鋅的富集載體

富集有機(jī)鋅的載體主要有三種：1、微生物包括大型真菌,酵母菌,益生菌等。2、植物類包括植物天然合成和種子發(fā)芽等。3、有些昆蟲也可富集,例如黃粉蟲幼蟲等,但昆蟲富集研究相對(duì)較少。

每100g動(dòng)物性食物中大約含鋅3～5mg,每100g植物性食物中大約含鋅1.0mg,但豆類、谷類、硬果類、菠菜、花生米、小米、芝麻、蘿卜、螺旋藻、茶葉等含鋅量比一些動(dòng)物［13］要高。由此可以看出動(dòng)物的富鋅量高于植物,但是由于日常動(dòng)物性食物所占比例較少,因此以動(dòng)物為富鋅載體研究較少,以植物為富鋅載體研究較多。

其中利用植物中的谷類［14］、豆類等主糧富集有機(jī)鋅,衍生出一種最新的技術(shù)叫生物強(qiáng)化技術(shù),生物強(qiáng)化是結(jié)合傳統(tǒng)育種實(shí)踐技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù),使微量營(yíng)養(yǎng)素富集在主糧作物中,從而改善世界范圍內(nèi)微量營(yíng)養(yǎng)素不良問(wèn)題的一種新型技術(shù),被看做是有效解決人類營(yíng)養(yǎng)不良途徑之一［15,16］。

在已有的研究中,尤其在保健品開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)中,微生物具有鋅富集量大、繁殖周期短、獲得成本低廉等特點(diǎn)。利用食用菌［17］將無(wú)機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為有機(jī)鋅,被認(rèn)為是補(bǔ)鋅的理想選擇.王艷等對(duì)食用菌液體培養(yǎng)載體進(jìn)行了比對(duì),認(rèn)為選擇羊肚菌作為食用菌富鋅實(shí)驗(yàn)的載體最為理想［18］。

在工業(yè)生產(chǎn)中,酵母菌使用最為廣泛,且其富集機(jī)理較為清楚［19,20］。采用自然篩選、單倍體分離、誘變、原生質(zhì)體融合技術(shù)選育到生物量搞得富鋅酵母菌,在含適量的無(wú)機(jī)鋅的培養(yǎng)基中培養(yǎng),能獲得生物量高、酵母細(xì)胞有機(jī)鋅含量高的富鋅酵母［21］,然而選取的酵母菌不同,使用的工藝和條件不同,酵母菌的含鋅量就不同。尋求一套成本最少、最為合理的酵母富鋅工藝和條件,現(xiàn)在的研究熱度很高。

4 檢測(cè)方法

在對(duì)有機(jī)鋅富集轉(zhuǎn)化的檢測(cè)過(guò)程中,一般要測(cè)定其富鋅生物量和鋅的有機(jī)化程度。富鋅生物量指富鋅載體內(nèi)的總含鋅量,包含生物體內(nèi)的無(wú)機(jī)鋅。鋅的有機(jī)化程度則是指富鋅載體內(nèi)有機(jī)鋅的含量占總鋅含量的比例,在螯（絡(luò)）合物中有機(jī)化程度指的就是螯（絡(luò)）合率。

4.1 富集生物量的檢測(cè)

富鋅生物量的檢測(cè)較為簡(jiǎn)單,因?yàn)椴恍枰獙o(wú)機(jī)鋅和有機(jī)鋅分離檢測(cè),而只需要檢測(cè)總含鋅量。

首先對(duì)載體進(jìn)行處理,使其轉(zhuǎn)化成離子態(tài)。然后一般采用經(jīng)典的雙硫腙-四氯化碳法［22］：根據(jù)鋅離子與雙硫腙形成紅色螯合物的原理,控制PH,利用四氯碳作為萃取劑,混色后用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。此方法中,混色法較為繁瑣,四氯化碳有毒,因此王魯民等［23］對(duì)混色法進(jìn)行了改進(jìn),魏獻(xiàn)軍等［24］對(duì)萃取劑和條件進(jìn)行了改進(jìn)。

王小莉［25］等認(rèn)為雙硫腙法雖然使用范圍較廣,但是操作繁瑣,于是發(fā)明了PAN分光光度法：在PH=9.28的四硼酸鈉緩沖介質(zhì)中,乙醇存在條件下,鋅離子與PAN生成1：2的紅色絡(luò)合物,利用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。以上方法都是使用原子分光光度法進(jìn)行測(cè)量,方法越來(lái)越簡(jiǎn)單,但是能夠測(cè)定的鋅離子濃度范圍和準(zhǔn)確度不同。

4.2 有機(jī)化程度的檢測(cè)

4.2.1 凝膠過(guò)濾色譜法 至今國(guó)內(nèi)外沒有對(duì)鋅的有機(jī)化程度測(cè)定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),在測(cè)定有機(jī)載體中,一般測(cè)定其螯合率作為有機(jī)化程度的標(biāo)準(zhǔn)。

螯合率是指有機(jī)微量元素中螯合元素占總元素的比例。利用凝膠過(guò)濾色譜法可以測(cè)定螯合率［26］,凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定是國(guó)標(biāo)《飼料添加劑蛋氨酸鐵（銅、錳、鋅）螯合率的測(cè)定凝膠過(guò)濾色譜法》（GB/ T 13080.2 -2005）, 通過(guò)將氨基酸鋅螯合物試樣在水中加熱、離心后,分成沉淀和溶液兩部分。由于鋅離子是溶于水的,所以認(rèn)為沉淀物所含鋅的形式為螯（絡(luò)）合物。溶液經(jīng)過(guò)凝膠分離、洗脫。然后用原子吸收光譜法測(cè)定沉淀態(tài)氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物及金屬離子的含量,分別計(jì)算出沉淀態(tài)氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物占金屬元素總量的比例即可計(jì)算出相應(yīng)的氨基酸螯合物的螯合率。此種方法極不穩(wěn)定,凝膠分離和洗脫等易產(chǎn)生誤差。

4.2.2 持續(xù)透析法 有一種間接測(cè)定有機(jī)鋅的方法是持續(xù)透析法,類似于《飼料添加劑甘氨酸鐵絡(luò)合物》（GB/T 21996-2008）檢測(cè)甘氨酸亞鐵中總甘氨酸和游離甘氨酸的含量的方法。馬根艷［27］和孫希雯［28］等利用持續(xù)透析法測(cè)定富鋅菌：精確稱取富鋅菌絲體,在雙蒸水中反復(fù)透析,直至用茚三銅法檢驗(yàn)透析液中無(wú)氨基酸為止,測(cè)定菌絲體中含鋅量。透析液中無(wú)機(jī)鋅可以代表富鋅菌絲體中的無(wú)機(jī)鋅含量,測(cè)出菌絲中含鋅總量,然后計(jì)算鋅的有機(jī)化程度。

4.2.3 靜置浸出法和有機(jī)溶劑萃取法［4］孫希雯等還利用靜置浸出法測(cè)定有機(jī)鋅含量［28］：將19富鋅金針菇粉末,加人2ml水,分別浸取不同時(shí)間, 過(guò)濾, 測(cè)定菌絲體中鋅含量。此種方法中利用水為溶劑,還可以利用有機(jī)溶劑作為溶劑,這就是有機(jī)溶劑萃取法。利用無(wú)機(jī)鋅易溶于有機(jī)溶劑,而絡(luò)（螯）合鋅溶解性很差的原理,測(cè)定有機(jī)鋅的含量。

4.2.4 測(cè)定可溶性氨基酸鋅 以上四種方法都面臨一個(gè)問(wèn)題,就是有機(jī)鋅同樣溶于水和有機(jī)溶劑,如何準(zhǔn)確的檢測(cè)水和有機(jī)溶劑中殘留的有機(jī)鋅？賈義［29］采取了一種測(cè)定可溶性氨基酸的方法：通過(guò)蒸餾水和EDTA將洗滌酵母細(xì)胞,將細(xì)胞的無(wú)機(jī)鋅和細(xì)胞壁鋅全部除去,然后利用酶裂解的方法,將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)變成原生質(zhì)體經(jīng)多次離心沉淀,得到總的上清液。然后對(duì)上清液中的蛋白質(zhì)用硫酸銨或者丙酮進(jìn)行沉淀,從而得到可溶性蛋白質(zhì),進(jìn)而測(cè)試其中鋅的含量,得出的即為可溶性蛋白結(jié)合鋅的量。以上四種方法,都需要對(duì)水和有機(jī)溶劑中的蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀,然后測(cè)定其中的可溶性蛋白結(jié)合鋅濃度,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

5 展望

利用生物強(qiáng)化技術(shù)使主糧富集微量元素鋅,從而解決微量元素鋅的缺乏問(wèn)題,是極為重要的研究項(xiàng)目。遵循綠色環(huán)境原則,富鋅載體可以對(duì)含鋅的工業(yè)污水等進(jìn)行處理,將無(wú)機(jī)鋅轉(zhuǎn)變成有機(jī)鋅,投入生產(chǎn)將會(huì)帶來(lái)可觀效益,如何選取最優(yōu)良、可廣泛使用的富鋅載體是未來(lái)研究的一個(gè)方向。

在有機(jī)鋅中只有螯合率的概念,卻沒有絡(luò)合率的概念,對(duì)以后的有機(jī)鋅檢測(cè)研究是一種阻礙,許甲平等［30］也對(duì)此進(jìn)行了說(shuō)明。

有機(jī)鋅的檢測(cè)沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),一般操作比較繁瑣,且在精度方面有待改良。有機(jī)溶劑萃取法中,對(duì)于不同產(chǎn)品,有機(jī)溶劑的選擇和使用量都有待探索。有機(jī)酸鋅鹽也屬于有機(jī)鋅,雖然量極少,但是對(duì)有機(jī)鋅的測(cè)定也有影響,需要探索其檢測(cè)方法。

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1674-2060（2016）03-0015-02