高效液相色譜法測定狼瘡性腎炎患兒血漿中環(huán)磷酰胺的含量

魯卓林 李惠芬 劉力 洪閣 紀?，?/p>

300134天津市兒童醫(yī)院藥劑科（魯卓林），風濕免疫科（劉力）；300134天津市兒童醫(yī)院兒科研究所（李惠芬）；300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室（洪閣、紀?，摚?/p>

高效液相色譜法測定狼瘡性腎炎患兒血漿中環(huán)磷酰胺的含量

魯卓林 李惠芬 劉力 洪閣 紀海瑩

300134天津市兒童醫(yī)院藥劑科（魯卓林），風濕免疫科（劉力）；300134天津市兒童醫(yī)院兒科研究所（李惠芬）；300192天津，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室（洪閣、紀海瑩）

目的 建立測定狼瘡性腎炎（LN）患兒血漿中環(huán)磷酰胺含量的高效液相色譜（HPLC）方法，為制訂個體化治療方案提供依據(jù)。方法 色譜柱為Hypersil ODS-2 C18柱，流動相為乙腈-水（體積比為30∶70），流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為195 nm，進樣量為20 μl。以異環(huán)磷酰胺為內標，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白、離心取上清液進樣檢測。結果 血漿中環(huán)磷酰胺的質量濃度在0.5～20.0 mg/L范圍內，環(huán)磷酰胺與內標的峰面積比呈良好的線性（r=0.999 4），最低檢出限為0.1 mg/L；日內、日間精密度和穩(wěn)定性實驗的相對標準偏差（RSD）均＜8%；加樣回收率為100.60%～101.05%，結果滿意。結論 該法簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好，可用于LN患兒血漿中環(huán)磷酰胺的含量測定及免疫抑制治療的臨床藥學監(jiān)護。

高效液相色譜法； 血藥濃度； 環(huán)磷酰胺； 狼瘡性腎炎

Fund program：Science and Technology Fund of Tianjin Municipal Health Bureau(2014KZ032)

0 引 言

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是一種兒童期常見的繼發(fā)性腎小球疾病，臨床表現(xiàn)為腎病綜合癥、急性腎炎綜合癥、慢性腎炎綜合癥及孤立性蛋白尿等[1]。從發(fā)病年齡看，主要集中于學齡期兒童，學齡前兒童及幼兒比例較少；從性別比例看，女性患兒的發(fā)病率明顯高于男性[2-3]。LN是兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）最嚴重的并發(fā)癥，直接影響著SLE患兒的生存質量及臨床預后[4]。目前，臨床上采用激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺的經(jīng)典治療方案來控制LN患兒的短期病程及長期預后[5]，但是由于環(huán)磷酰胺毒副作用大、安全范圍窄，特別是在不同人群和不同疾病狀態(tài)下，其體內藥代動力學行為存在明顯差異，為保證患者的用藥安全，需要對環(huán)磷酰胺的血藥濃度進行實時監(jiān)測。

近年來，國內外有關高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定血漿中環(huán)磷酰胺含量的研究相對較少。De Miranda Silva等[6]和Silvertand等[7]采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS）法分別對乳腺癌和惡性血液病患者血漿中環(huán)磷酰胺的藥代動力學進行了研究，雖然此方法靈敏度高、專屬性強，但由于測試儀器操作復雜、價格昂貴，直接導致檢測成本較高。王來成等[8]和黎遠冬等[9]采用HPLC法分別對23例小兒難治性腎病綜合征（refractory nephrotic syndrome，RNS）和2例腫瘤患者血漿中環(huán)磷酰胺的血藥濃度進行了測定，雖然檢測方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，但在流速和分析時間設定方面仍存在一些值得探討的問題。

本研究建立了HPLC測定LN患兒血漿中環(huán)磷酰胺含量的方法。該法簡單、快速、準確，可用于治療窗窄、個體化差異大的兒童血藥濃度檢測和藥代動力學研究標準化操作規(guī)程的建立，為減少化療藥物的不合理使用和制訂個體化給藥方案提供技術支持。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年5月至2015年8月天津市兒童醫(yī)院收治的LN（Ⅳ型）患兒9例，年齡為5～14歲，平均年齡為（9.2±2.8）歲，平均體質量為（29.5±2.8）kg。

1.2 主要材料與儀器

環(huán)磷酰胺對照品（批號為100234-201303）、異環(huán)磷酰胺對照品（批號為100595-201302）（中國食品藥品檢定研究院），醋酸潑尼松片（批號為1408069）（天津力生制藥股份有限公司），注射用環(huán)磷酰胺（批號為14082125）（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。空白血漿采自健康兒童，由天津市兒童醫(yī)院血庫提供。

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），ME55電子天平（瑞士Mettler Toledo國際有限公司），Mili-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

液相色譜柱為Thermo Fisher HypersilTMODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（體積比為30∶70），流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為195 nm，進樣量為20 μl。

1.3.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取環(huán)磷酰胺對照品10.0mg，置于50 ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

內標溶液：精密稱取異環(huán)磷酰胺對照品10.0mg，置于10 ml容量瓶中，加無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.3 血漿樣品的處理

精密吸取250 μl血漿樣品，置于1.5 ml離心管中，精確加入5 μl內標溶液，再加入1 ml甲醇，旋渦混勻30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液20 μl進樣測定[10-12]。

1.3.4 系統(tǒng)適用性實驗

分別取空白血漿、加藥血漿（精密吸取250 μl空白血漿，加入25 μl對照品溶液）和血漿樣品（LN患兒按500 mg/m2靜脈滴注環(huán)磷酰胺，給藥后抽取靜脈血樣，分離血漿），按血漿樣品處理方法操作（空白血漿不加內標溶液），取上清液20 μl，按色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

1.3.5 線性范圍和檢出限的測定

取空白血漿，加入適量對照品溶液，配制環(huán)磷酰胺質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列血漿樣品，按血漿樣品處理方法操作，取上清液20 μl，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以環(huán)磷酰胺的質量濃度（mg/L）為橫坐標（x），環(huán)磷酰胺與內標（異環(huán)磷酰胺）的峰面積比為縱坐標（y），進行線性回歸分析。

取上述血漿樣品，逐級稀釋，按血漿樣品處理方法操作。取上清液20 μl，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算環(huán)磷酰胺色譜峰峰高與噪聲的比值（信噪比），以信噪比為3時血漿樣品中所含環(huán)磷酰胺的量為檢測限。

1.3.6 精密度實驗

取空白血漿，加入適量對照品溶液，配制環(huán)磷酰胺質量濃度分別為5.0、10.0、20.0 mg/L的血漿樣品，每個濃度設5個平行樣，按血漿樣品處理方法操作，取上清液20 μl，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積。同日內每個質量濃度的血漿樣品平行操作5次，同時每天操作1次，連續(xù)考察5 d，分別計算日內和日間精密度。

1.3.7 穩(wěn)定性實驗

取空白血漿，加入適量對照品溶液，配制環(huán)磷酰胺質量濃度分別為5.0、10.0、20.0 mg/L的血漿樣品，每個濃度設5個平行樣，按血漿樣品處理方法操作，取上清液20 μl，分別于室溫放置0、1、2、3、4、5、6 h后，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積，考察血漿樣品室溫存放期間的穩(wěn)定性。

1.3.8 回收率實驗

取空白血漿，加入適量對照品溶液，配制環(huán)磷酰胺質量濃度分別為5.0、10.0、20.0 mg/L的血漿樣品，每個濃度設5個平行樣，按血漿樣品處理方法操作，取上清液20 μl，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積，依據(jù)標準曲線計算血漿樣品中環(huán)磷酰胺的含量，并計算回收率。

1.3.9 LN患兒血漿樣本的測定

采用口服激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺靜脈注射的沖擊治療方案：每例患兒按1 mg/kg給予口服醋酸潑尼松片，同時按500 mg/m2靜脈滴注環(huán)磷酰胺，于給藥1、12、24 h后分別抽取患兒靜脈血樣，分離血漿，按血漿樣品處理方法操作后取上清20 μl，按色譜條件測定環(huán)磷酰胺的血藥濃度。

2 結果

2.1 系統(tǒng)適用性實驗

由圖1可知，血漿中的內源性物質對環(huán)磷酰胺的檢測無干擾。色譜基線平穩(wěn)，加藥血漿和LN患兒血漿按環(huán)磷酰胺計理論塔板數(shù)均≥5 000，且環(huán)磷酰胺主峰與內標及各相關物質均可達到基線分離，分離度均＞1.5。環(huán)磷酰胺與內標的保留時間分別為4.66 min和4.28 min。

2.2 線性范圍和檢出限的測定

測定結果表明，血漿中環(huán)磷酰胺的質量濃度在0.5～20.0 mg/L范圍內，環(huán)磷酰胺與內標的峰面積比線性關系良好，環(huán)磷酰胺的回歸方程為y=0.0471x-0.006 9（r=0.999 4），血漿中環(huán)磷酰胺的最低檢出限為0.1 mg/L。

2.3 精密度實驗

由表1可知，本研究建立的測定方法精密度較好，平均日內精密度為4.30%，平均日間精密度為4.48%，且日內、日間精密度的RSD均＜8%。

表1 加藥血漿中環(huán)磷酰胺的精密度（n=5，x±s）

2.4 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗結果表明，加藥血漿在6 h內穩(wěn)定性良好，可滿足檢測需求；不同質量濃度的環(huán)磷酰胺峰面積的RSD分別為6.79%、2.12%和3.41%。（表2）

表2 加藥血漿中環(huán)磷酰胺的穩(wěn)定性（n=5，x±s）

2.5 回收率實驗

向空白血漿中加入適量對照品溶液使環(huán)磷酰胺的質量濃度分別為5、10、20 μg/ml，其加樣回收率為100.60%～101.05%，結果滿意。（表3）

表3 加藥血漿中環(huán)磷酰胺的添加回收率（n=5，x±s）

圖1 空白血漿、加藥血漿及狼瘡性腎炎患兒血漿的高效液相色譜圖

2.6 LN患兒血漿樣本的測定

按500 mg/m2靜脈滴注環(huán)磷酰胺1、12、24 h后，LN患兒血漿中環(huán)磷酰胺的血藥濃度分別為（12.29± 3.40）、（3.21±1.19）、（0.65±0.71）mg/L。結果表明，本研究建立的測定LN患兒血漿中環(huán)磷酰胺含量的方法簡便、快速、準確，可用于環(huán)磷酰胺的血藥濃度監(jiān)測。（表4）

表4 狼瘡性腎炎患兒靜脈滴注環(huán)磷酰胺后不同時間血藥濃度的檢測結果

3 討論與結論

激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺靜脈沖擊療法是目前LN（Ⅳ型）患兒的一線治療方案，可有效地控制狼瘡活動，明顯減輕血尿和蛋白尿，改善腎功能，但也存在療程長、總劑量大（150 mg/kg）、副反應較多（如肝毒性、骨髓抑制和性腺毒性）等缺陷[13]。在臨床應用過程中，為了確保治療方案的安全、有效和經(jīng)濟，減少免疫抑制劑的濫用和藥品不良反應的發(fā)生，需要合理掌握環(huán)磷酰胺的給藥劑量、用藥間隔和治療周期[14]。同時，環(huán)磷酰胺是一種典型的前體藥物，須在體內經(jīng)肝藥酶代謝活化才能發(fā)揮治療效果。當血藥濃度升至一定水平后，環(huán)磷酰胺在肝臟的活性代謝會達到飽和，而肝臟滅活的代謝支路會得到加強，產(chǎn)生氯乙醛等毒性代謝產(chǎn)物，此時若繼續(xù)增大用量將不會提高療效而只會產(chǎn)生更大的毒性反應[8]。因此，在治療方案實施過程中需對環(huán)磷酰胺進行臨床藥代動力學監(jiān)測，以使患兒得到更安全有效地治療。

據(jù)文獻報道，環(huán)磷酰胺血藥濃度的測定方法有氣相色譜（gas chromatography,GC）、HPLC和HPLCMS法等。其中，以GC法的靈敏度最高，但由于樣品前處理過程中存在衍生化反應副產(chǎn)物較多、提取效率低和部分代謝物不穩(wěn)定等原因，限制了該法的廣泛應用[15]。近年來發(fā)展起來的HPLC-MS法同樣具有專屬性強和檢出限低的優(yōu)點，但也存在分析時間長、測定成本高和操作復雜等缺點[16]。本研究采用配有紫外檢測器的HPLC，以甲醇沉淀蛋白后直接測定環(huán)磷酰胺的血藥濃度，其血漿樣品處理步驟簡單、快速，色譜分析時間短，回收率高，重復性好，可在有限的時間內完成大批量患兒血漿樣本中環(huán)磷酰胺的含量測定，適合在治療藥物監(jiān)測中推廣應用。

本研究考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水為流動相時的色譜分離效果，并參考文獻[17]以緩沖鹽溶液代替水相來改善色譜峰形；經(jīng)綜合比較，最終選擇乙腈-水（體積比為30∶70）為流動相，該條件下環(huán)磷酰胺與內標物可完全分離，且不受內源性物質及其他雜質干擾。通過將對照品溶液在190～400 nm范圍內進行紫外-可見光譜掃描，發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺在195 nm波長附近有最大吸收，故選195 nm作為檢測波長。環(huán)磷酰胺在LN患兒體內的藥代動力學行為存在個體差異，筆者對9例患兒的檢測結果顯示，給藥后1、12和24 h血藥濃度的波動范圍較大，體現(xiàn)出明顯的個體化差異，與國內報道比較接近[8]，符合兒童群體藥代動力學研究的特點，提示應收集更多的臨床樣本深入研究血藥濃度與治療效果之間的關系，為及時調整治療方案和保證患兒用藥安全提供理論依據(jù)。

利益沖突 無

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Determination of cyclophosphamide in plasma of children with lupus nephritis by HPLC

Lu Zhuolin,Li Huifen,Liu Li,Hong Ge,Ji Haiying

Department of Pharmacy(Lu ZL),Department of Rheumatology(Liu L),Tianjin Children's Hospital,Tianjin 300134, China;Institute of Pediatrics,Tianjin Children's Hospital,Tianjin 300134,China(Li HF);Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China(Hong G,Ji HY)

Liu Li,Email:may13_cn@126.com

Objective To establish an high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of cyclophosphamide in plasma of children with lupus nephritis(LN),and to provide basis for the individualized drug therapy.Methods HPLC was performed on the column of Hypersil ODS-2 C18 with the mobile phase of acetonitrile-water(30∶70,V/V)at a flow rate of 1.0 ml/min.The column temperature was 30℃,and the detection wavelength was 195 nm.The injection volume was 20 μl.The plasma samples were deproteinized by methol with ifosfamide as the internal standard,and the centrifugal supernatant was injected for analysis.Results The linear range of plasma cyclophosphamide of children with LN was 0.5-20.0 mg/L(r=0.999 4).The detection limit of cyclophosphamide was 0.1 mg/L.Relative standard deviation(RSD)of stability,the intra-day and inter-day precisions were all less than 8%.The recovery rate was 100.60%-101.05%,and the result was satisfactory.Conclusions The method is simple,rapid,accurate,convenient and with good reproducibility.It can be used for the determination of plasma cyclophosphamide concentration of children with LN and clinical pharmaceutical care of immunosuppressive therapy.

High performance liquid chromatography; Plasma concentration; Cyclophosphamide; Lupus nephritis

劉力，Email:may13_cn@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2016.05.008

天津市衛(wèi)生局科技基金（2014KZ032）

2016-07-12）