香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌體外抗真菌的作用

黃奕曦，沈志濱，江濤，陳艷芬，劉家媛，張莉莉，唐春萍

(廣東藥學(xué)院1.中藥學(xué)院； 2.實驗動物中心，廣東 廣州 510006)

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香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌體外抗真菌的作用

黃奕曦1，沈志濱1，江濤2，陳艷芬1，劉家媛1，張莉莉1，唐春萍1

(廣東藥學(xué)院1.中藥學(xué)院； 2.實驗動物中心，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量液基稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位(簡稱DF)對紅色毛癬菌的體外抗真菌作用，并比較兩種方法的一致性。方法 利用兩種方法測定DF對紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株(6株)和臨床分離菌株(7株)的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MFC)。 結(jié)果 試管稀釋法測定DF對13株紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.469～15.0 mg/mL；MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL。其中DF對標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC范圍為生藥0.469～7.5 mg/mL，幾何均值為2.652 mg/mL，MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL，幾何均值為3.750 mg/mL。微量稀釋法測定DF對紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC范圍為生藥0.312 5～5.0 mg/mL，幾何均值為1.25 mg/mL；其MFC范圍為生藥1.25～20.0 mg/mL，幾何均值為5.0 mg/mL。 結(jié)論 香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌有抑菌作用和殺菌作用，兩種方法的測定結(jié)果有較好的一致性。

關(guān)鍵詞:香鱗毛蕨； 紅色毛癬菌； 試管稀釋法； 微量稀釋法； 最低抑菌濃度； 最低殺菌濃度

淺部真菌病是指皮膚、指甲、毛發(fā)發(fā)生的真菌感染，是臨床最常見的真菌病。人類淺部真菌病的致病病原菌中，紅色毛癬菌所占比例達90%[1]。隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素、抗腫瘤藥物等的長期、廣泛以及不合理應(yīng)用，逐漸出現(xiàn)耐藥真菌菌株。因耐藥菌株感染導(dǎo)致的治療失敗與日俱增[2]。另外，一些抗菌藥物具有肝毒性[3]、腎毒性[4]等副作用，因此從傳統(tǒng)中草藥中尋求抗真菌有效部位和有效成分具有廣闊的研發(fā)前景。

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott.為鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(DryopterisAdans.)植物[5],在我國主要分布于東北地區(qū)。根據(jù)民間驗方記載香鱗毛蕨對多種皮膚病(體癬、手足癬等)均有較好的治療效果[6]。近年國內(nèi)學(xué)者研究主要圍繞香鱗毛蕨的抗真菌活性成分篩選[7-8]，但其抗紅色毛癬菌物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚。為了明確香鱗毛蕨治療淺部真菌病的有效部位，本實驗采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量稀釋法對多株紅色毛癬菌進行試驗，進一步評價香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌的抑菌作用，并比較兩種方法的一致性，為中藥體外抗真菌活性評價和香鱗毛蕨進一步的研究提供實驗依據(jù)。

1材料與儀器

1.1實驗菌株

紅色毛癬菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株6株和臨床分離株7株)和近平滑念珠菌(質(zhì)控菌株，編號ATCC22019)，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所(南京)。

1.2實驗藥品

香鱗毛蕨采自中國黑龍江省，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物；大扶康(氟康唑氯化鈉注射液，輝瑞制藥有限公司，批號：A434403)；瓊脂粉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：39H108200)；葡萄糖(Genview，批號：3805010212)；蛋白胨(OXOID，批號：1113141)； RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司，批號：1256837)。

1.3實驗儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)；PB-10酸度計(Sartorius)；血球計數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

2方法

2.1香鱗毛蕨有效部位(簡稱DF)貯備液的制備

由廣東藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室制備，香鱗毛蕨藥材用50%(φ)乙醇浸提，經(jīng)過濃縮、酸沉、離心分離后，得到浸膏，然后配制成含生藥質(zhì)量濃度2 g/mL的貯備液，其主要物質(zhì)成分為間苯三酚類化合物，經(jīng)紫外含量測定，總間苯三酚含量達到50%以上。無菌處理：用0.45 μm針式濾器過濾分裝貯備液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2試管稀釋法

2.2.1沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的配制[8]稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、瓊脂18 g，量取蒸餾水1 000 mL置燒杯中攪拌混勻，并用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)整pH值至5.6±0.2。培養(yǎng)基分裝和密封后，進行121 ℃高壓滅菌20 min。置于4 ℃冰箱備用保存。沙氏液體培養(yǎng)基[9]，除不加瓊脂外其他成分與制法同上。

2.2.2含藥培養(yǎng)基的制備將“2.2.1”沙氏瓊脂培養(yǎng)基分裝試管后高溫滅菌，待滅菌培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，將香鱗毛蕨貯備液加入，混勻。將DF分成10個濃度梯度制成斜面，終質(zhì)量濃度分別為含生藥120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 mg/mL。取生長對照管(陽性對照)和空白瓊脂管(陰性對照)作對照。重復(fù)3次實驗。

2.2.3菌懸液的制備將受試菌株紅色毛癬菌接種于含沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的培養(yǎng)皿上28 ℃培養(yǎng)7～10 d充分活化后，用接種環(huán)刮取已轉(zhuǎn)種活化的紅色毛癬菌，置于組織研磨器中，加入0.85%無菌生理鹽水，研磨均勻，經(jīng)血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度至1.0×106～6.0×106cfu/mL備用。

2.2.4最低抑菌濃度(MIC)測定將已制備的菌液100 μL接種到含藥培養(yǎng)基和對照管培養(yǎng)基的表面，28 ℃孵育7～10 d后判讀結(jié)果。MIC值的判讀：在培養(yǎng)過程中由2人在自然光線下通過肉眼判讀。將每管生長情況與對照管作比較，以最低藥物濃度無培養(yǎng)物生長的藥基管為MIC終點，該藥物濃度即為該藥液對該種菌的MIC值，取3次濃度的平均值。

2.2.5最低殺菌濃度(MFC)測定[7]在“2.2.4”實驗中無培養(yǎng)物生長的藥基管加入經(jīng)滅菌的液體沙氏培養(yǎng)基，用接種環(huán)輕刮取藥基管斜面表面，充分振蕩后倒入無菌試管中。然后置于28 ℃孵育10～12 d進行次代培養(yǎng)，觀察結(jié)果。MFC值的判讀：測定的液體培養(yǎng)基與空白對照管對比，若液體培養(yǎng)基清晰透亮，表示該MIC濃度完全抑制真菌生長。若液體培養(yǎng)基渾濁，該MIC濃度未完全抑制真菌生長；以最低藥物濃度無培養(yǎng)物生長的液基管為MFC終點。

2.3微量稀釋法

2.3.1RPMI-1640培養(yǎng)基的配制[10]參照美國CLSI頒布的產(chǎn)孢絲狀真菌抗真菌藥敏試驗方案(M38-A2)提供的方法進行。

2.3.2燕麥培養(yǎng)基(oatmeal agar)的配制稱取燕麥片30 g，加水1 000 mL,煮沸30 min，用紗布過濾后補足水至1 000 mL,加瓊脂粉15 g溶化后分裝滅菌后使用。

2.3.3菌懸液的制備采用燕麥培養(yǎng)基對紅色毛癬菌進行活化培養(yǎng)4～5 d，菌懸液配制操作同“2.2.3”。

2.3.4MIC的測定將“2.1”制備的DF用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成含生藥質(zhì)量濃度20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL 10個梯度濃度的含藥物的培養(yǎng)基液，然后由高至低依次在96孔板上第1～10列加入100 μL。第11列作為生長對照加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，第12列作為空白對照，加入RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL。紅色毛癬菌懸液用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至2.0×103～6.0×103CFU/mL[11]，分別加入至96孔板第1～11列各孔100 μL，加蓋密封后置于35 ℃溫箱培養(yǎng)4 d。實驗結(jié)果判讀：只有當(dāng)生長對照生長良好且質(zhì)控菌株MIC在規(guī)定范圍內(nèi)，可由2人共同判讀，取無紅色毛癬菌生長的孔作為最低藥物質(zhì)量濃度，即DF的MIC值。

2.3.5MFC的測定根據(jù)“2.3.4”的MIC測定的結(jié)果，取判讀后大于MIC的各孔中的液體100 μL，在無菌條件下接種于SDA培養(yǎng)基平皿，進行次代培養(yǎng)，觀察是否有真菌長出。

2.3.6質(zhì)量控制在每次測定的同時，在平行操作條件下進行質(zhì)量控制。質(zhì)控(QC) 株采用經(jīng)培養(yǎng)活化的近平滑念珠菌(編號ATCC 22019)，質(zhì)控陽性藥物為氟康唑，操作過程按照M38-A2方案中的要求進行，QC株的MIC值結(jié)果在1.0～4.0 μg/mL范圍內(nèi)，視為測定結(jié)果有效可信。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1試管稀釋法

結(jié)果見表1。生長對照管中的紅色毛癬菌覆蓋試管斜面，生長良好。DF對13株紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.469～15.0 mg/mL，幾何均值為3.750 mg/mL，其MFC范圍為生藥0.938～15.0 mg/mL，幾何均值為4.896 mg/mL。6個標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC幾何均值為生藥2.652 mg/mL，MFC幾何均值為生藥3.750 mg/mL。7個臨床菌株的MIC幾何均值為生藥5.047 mg/mL， MFC幾何均值為生藥6.153 mg/mL。由于不同菌株對DF的敏感性不同，故所呈現(xiàn)的MIC值也不同。

3.2微量稀釋法

結(jié)果見表2。生長對照組紅色毛癬菌覆蓋96孔板的底部，生長良好。DF對紅色毛癬菌的MIC范圍為生藥0.312 5～5.0 mg/mL，幾何均值為生藥1.25 mg/mL；其MFC范圍為生藥1.25～20.0 mg/mL，幾何均值為生藥5.0 mg/mL。

3.3兩種方法測定結(jié)果比較

通過采用試管稀釋法和CLSI M38-A2微量稀釋法兩種方法，測定DF對紅色毛癬菌的MIC和MFC值。結(jié)果顯示，測定的MIC值波動在1～2個稀釋梯度內(nèi)，兩種方法之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。在標(biāo)準(zhǔn)菌株的實驗結(jié)果中(見表1、表2)，試管稀釋法中比較敏感的菌株(MIC值較小)，在微量稀釋法中同樣敏感，即同一種菌株在兩種實驗方法測得的MIC值結(jié)果具有一定相關(guān)性。

表1　試管稀釋法測定香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌的MIC值和MFC值

注：#為臨床分離株編號，其余為標(biāo)準(zhǔn)菌株編號；表中結(jié)果顯示為MIC/MFC，+表示有紅色毛癬菌生長，-表示無紅色毛癬菌生長。

表2　微量稀釋法測定香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌的MIC值和MFC值

注：編號為標(biāo)準(zhǔn)株編號；表中結(jié)果顯示為MIC/MFC，+表示有紅色毛癬菌生長，-表示無紅色毛癬菌生長。

表3　兩種方法測定香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌抑制作用的比較

4討論

目前國內(nèi)研究中草藥抗真菌活性的實驗方法，以試管稀釋法和微量稀釋法為主要研究方法[12]。試管稀釋法屬于瓊脂稀釋法的一種，準(zhǔn)確性較佳，重復(fù)性較好。由于真菌的生長受藥物抑制出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，可能會導(dǎo)致某些藥物的終點判斷困難[13]，而且試管稀釋法對受試藥量需求較大，不利于對中藥分離成分量小的單體探究。國內(nèi)學(xué)者主要采用試管稀釋法對香鱗毛蕨的活性成分進行篩選[7-8]，而且實驗中同種菌種的株數(shù)僅為單株，缺少菌株數(shù)量及其多樣性對藥物抗菌活性的影響研究。

2008年美國 (CLSI)頒布了對酵母菌[14]和絲狀真菌[10]的微量稀釋法的標(biāo)準(zhǔn)化方案，研究者才開始按照CLSI M38-A2微量液基稀釋法來研究藥物對皮膚癬菌的體外抗菌作用。微量稀釋法用量少，敏感度高，能在篩選單體過程中解決受制于從植物中分離提取單體的藥量不足影響。目前，國內(nèi)采用微量稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位對真菌的體外抗真菌作用的報道較少，也未見采用CLSI M38-A2微量稀釋法研究香鱗毛蕨有效部位抗紅色毛癬菌作用研究的報道。本課題組采用了微量稀釋法研究發(fā)現(xiàn)DF對申克孢子絲菌和糠秕馬拉色菌有一定抑制作用[15-16]。王靜[17]采用微量稀釋法研究表明從香鱗毛蕨中分離出7個單體化合物中有3個單體對斷發(fā)毛癬菌和石膏樣小孢子菌有抑制作用。本研究首次采用微量稀釋法測定香鱗毛蕨有效部位(有效成分總間苯三酚含量達50%以上)對多株紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的MIC值和MFC值，結(jié)果表明DF有較強的抑菌和殺菌作用。

間苯三酚類是鱗毛蕨屬植物的主要特征化學(xué)成分，也是產(chǎn)生藥理活性的主要成分。大量實驗表明該屬植物的抗微生物活性與間苯三酚的含量高存在密切相關(guān)[7,18-19]。本研究表明香鱗毛蕨有效部位(有效成分總間苯三酚含量達50%以上)有較強的抗真菌作用，推測總間苯三酚類可能是香鱗毛蕨主要的抑菌藥效物質(zhì)。有文獻報道采用微量法對真菌同一菌株進行實驗，所得的MIC 在2個濃度梯度內(nèi)，可認(rèn)為兩種方法測定的結(jié)果一致[20-21]。本實驗以6株紅色毛癬菌標(biāo)準(zhǔn)菌為研究對象，比較試管稀釋法和微量稀釋法測定的結(jié)果， MIC值波動在1～2個稀釋梯度內(nèi)，研究結(jié)果表明兩種方法的測定結(jié)果有一定的一致性。

由于皮膚癬菌的生長特性各有不同，尤其是紅色毛癬菌，進行紅色毛癬菌體外藥敏試驗最重要的一環(huán)就是選擇能促進分生孢子形成的培養(yǎng)基。夏修蛟[22]針對紅色毛癬菌的生長特性在培養(yǎng)基方面進行研究，發(fā)現(xiàn)燕麥培養(yǎng)基比其他常用真菌培養(yǎng)基(如沙氏葡萄糖瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、玉米粉吐溫-80 ℃瓊脂等培養(yǎng)基)產(chǎn)孢更豐富。針對紅色毛癬菌產(chǎn)孢難的問題，本實驗在使用微量稀釋法時曾采用SDA進行誘導(dǎo)培養(yǎng)得出的實驗結(jié)果不穩(wěn)定，產(chǎn)孢較少，改用燕麥培養(yǎng)基后所得出的實驗結(jié)果比較穩(wěn)定，產(chǎn)孢較多。另外，在確定了DF有效部位的基礎(chǔ)上，可通過對總間苯三酚類物質(zhì)進行分離，尋找有效部位中的有效單體成分，從而進一步探究香鱗毛蕨有效部位物質(zhì)基礎(chǔ)及其單體對紅色毛癬菌的抑制作用。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Antifungal effect of the active fraction ofDryopterisfragranson Trichophyton rubruminvitro

HUANG Yixi1,SHEN Zhibin1,JIANG Tao2,CHEN Yanfen1,LIU Jiayuan1,ZHANG Lili1,TANG Chunping1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.LaboratoryAnimalCenter,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To study the antifungal effect of the active fraction of Dryopteris fragrans (L.) Schott (DF) on Trichophyton rubrum by the test tube dilution and CLSI M38-A2 broth microdilution methods,and compare their consistency. Methods Two methods were used to detect the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicide concentration (MFC) against Trichophyton rubrum's 6 standard strains and 7 clinical isolates. Results The test tube dilution method determined the fungicidal activity of DF against Trichophyton rubrum,with the MIC values ranging from 0.469 to 15.0 mg/mL (for the crude herb) and the MFC values ranging from 0.938 to 15.0 mg/mL. Among the Trichophyton rubrum's standard strains,the MIC values ranged from 0.469 to 7.5 mg/mL (for the crude herb) and the geometric mean (GM) value of MIC was 2.652 mg/mL,while the MFC values ranged from 0.938 to 15.0 mg/mL and the GM value of MFC was 3.750 mg/mL. The broth microdilution method also showed the fungicidal activity of DF against Trichophyton rubrum’s standard strains. The MIC values ranged from 0.312 5 to 5.0 mg/mL (for the crude herb) and the GM value of MIC was 1.25 mg/mL,while the MFC values ranged from 1.25 to 20.0 mg/mL and the GM value of MFC was 5.0 mg/mL. Conclusion The active fraction of Dryopteris fragrans exerts antifungal effect against Trichophyton rubrum. Two detection methods show a proper consistency.

Key words:Dryopteris fragrans; Trichophyton rubrum; test tube dilution method; broth microdilution method; minimum inhibitory concentration; minimum fungicide concentration

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102801

中圖分類號:R285.5

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0078-05

作者簡介：黃奕曦(1989—)，男，2013級碩士研究生，Email: hyx2288@qq.com；通信作者: 唐春萍(1966—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效與安全性評價研究，Email: tchp66@163.com。

基金項目：科技部“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目(2011ZX09102-007-03)；廣東省科技廳科技計劃項目(2010B030700044，2011A030100013)；廣州市科技局科技計劃項目(12A062131631)；2015年廣東省公益研究與能力建設(shè)專項資金項目(2015A030302088)

收稿日期：2015-10-28

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-12 10:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.1037.002.html