香鱗毛蕨藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉海燕，杜文釗，宋國強(qiáng)，陳文浩，袁麗鵬，沈志濱

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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香鱗毛蕨藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉海燕，杜文釗，宋國強(qiáng)，陳文浩，袁麗鵬，沈志濱

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 建立香鱗毛蕨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為控制其質(zhì)量提供試驗(yàn)依據(jù)。方法 采用性狀、顯微鑒別法對(duì)香鱗毛蕨藥材的性狀、顯微特征進(jìn)行描述；參照2015年版《中國藥典》四部通則相關(guān)方法，對(duì)該藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定；采用薄層色譜法，分別以綿馬素BB(aspidin BB)和對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)該藥材進(jìn)行定性鑒別；采用紫外分光光度法，以綿馬素BB為指標(biāo)，建立了該藥材中總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法。結(jié)果 香鱗毛蕨藥材的性狀、顯微、薄層鑒別方法均具有很好的專屬性，6批樣品的水分、總灰分酸、不溶性灰分、醇溶性浸出物平均值分別為9.45%、9.38%、1.58%、20.8%，總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)以綿馬素BB計(jì)，為40.78 mg/g。結(jié)論 建立了香鱗毛蕨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于香鱗毛蕨的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:香鱗毛蕨； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 綿馬素BB； 總間苯三酚； 固藍(lán)B鹽

香鱗毛蕨為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.) Schott的干燥地上部分，在《中國植物志》和《遼寧植物志》中均有記載[1-2]，為民間常用藥。秋季采收，除去泥沙、曬干，即可藥用。據(jù)北方民間驗(yàn)方記載，香鱗毛蕨能治療各種皮膚病，如銀屑病、手癬、皮炎、皮疹、腳氣等等，尤其對(duì)銀屑病的治療效果非常顯著，被黑龍江省北部的居民視為“皮膚病的克星”[3-5]。香鱗毛蕨主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、內(nèi)蒙古、新疆等省區(qū)，在俄羅斯(遠(yuǎn)東地區(qū))、日本、朝鮮、歐洲、北美也有分布。它生于林下、巖石縫，海拔700～2 400 m處。

鱗毛蕨屬植物的主要成分為間苯三酚類衍生物，對(duì)真菌引起的腳氣、腳癬等皮膚病具有抑制作用[6]；因此，測(cè)定香鱗毛蕨中總間苯三酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量的優(yōu)劣具有重要意義。目前，關(guān)于香鱗毛蕨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究鮮有報(bào)道[7]。綿馬素BB是香鱗毛蕨的主要特征性化學(xué)成分，也是產(chǎn)生藥理活性的主要成分，且在香鱗毛蕨中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，制備方法較為成熟[8]。因此，本文在對(duì)香鱗毛蕨藥材的性狀、鑒別(顯微、薄層)、檢查(水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物)等項(xiàng)目進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，利用可見分光光度法，以綿馬素BB為測(cè)定指標(biāo)[9]，應(yīng)用綿馬素BB的酚羥基能與固藍(lán) B 鹽(即氯化四氮鄰二甲氧基苯胺)發(fā)生專屬性顯色反應(yīng)，顯色后形成的偶氮化合物在波長460～480 nm之間具有最大吸收的原理，測(cè)定總間苯三酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為香鱗毛蕨的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器

Olympus BX-51顯微數(shù)碼顯微鏡(德國麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司)，Shimadzu UV-2450紫外可見分光光度儀 (天津?qū)嶒?yàn)儀器廠)，AB135-S 型十萬分之一電子天平(瑞士Mettler 公司)。

1.2試藥

對(duì)照藥材經(jīng)中國科學(xué)院華南植物研究所葉華谷研究員鑒定為香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.) Schott.藥材。6批香鱗毛蕨樣品分別于不同時(shí)間購于黑龍江省五大連池，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連副教授鑒定為香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L. ) Schott.地上全草，將藥材陰干，去除根莖及葉柄殘基以外的其他部分，粉碎，備用，詳細(xì)信息見表1。

表1　香鱗毛蕨對(duì)照藥材、樣品信息表

綿馬素BB對(duì)照品(自制，經(jīng)面積歸一化法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)，固藍(lán)B鹽(上?；瘜W(xué)試劑廠，批號(hào)：20100308)，硅膠GF254預(yù)制板(青島海洋化工廠分廠)，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1原植物及生態(tài)[10-11]

經(jīng)形態(tài)觀察，本品為野生多年生蕨類植物，植株高約20～30 cm。根狀莖直立或斜升，頂端連同葉柄基部密被紅棕色、膜質(zhì)、卵圓形或卵圓披針形，先端短漸尖，邊緣疏具鋸齒的鱗片。葉簇生，葉柄通常長僅1～2 cm，生于石縫中的植株，長可達(dá)12 cm，禾稈色，有溝槽，密被紅棕色，長圓披針形，邊緣具鋸齒的鱗片和金黃色腺體；葉片長圓披針形，長10～25 cm，中部寬約2～4 cm，先端短漸尖，向基部逐漸狹縮，最基部寬不足1 cm，二回羽狀至三回羽裂；羽片約20對(duì)，斜展，彼此靠近，常相接，披針形，鈍尖至急尖頭，中部羽片長約1.5～2 cm，基部寬約6～8 cm，下部數(shù)對(duì)狹縮呈耳狀，羽狀或羽狀深裂；小羽片(裂片)矩圓形，邊緣具鋸齒或淺裂。葉草質(zhì)，干后上面褐色，下面棕色，兩面光滑，沿葉軸與羽軸被亮棕色披針形鱗片和腺體，葉脈羽狀，兩面不顯。孢子囊群圓形，背生于小脈上；囊群蓋膜質(zhì)，圓形至圓腎形，邊緣疏具鋸齒，大，成熟后彼此靠近并往往伸出葉邊之外，背面具腺體。孢子橢圓形，周壁具瘤狀突起，染色體n=41，二倍體。香鱗毛蕨原植物圖見圖1。

2.2性狀

本品植株高 20～30 cm，葉簇生，具柄，葉柄長 5～8 cm，禾稈色，有溝槽，密被紅棕色，長圓披針形，邊緣具鋸齒鱗片和金黃色腺體；葉片長圓披針形，長10～25 cm，中部寬約2～4 cm，草質(zhì)，2回羽狀至3回羽裂；羽片約20對(duì)，披針形，鈍尖至急尖頭，中部羽片長約1.5～2 cm，基部寬約6～8 cm，下部數(shù)對(duì)狹縮呈耳狀，羽狀或羽狀深裂；小羽片(裂片)矩圓形，邊緣具鋸齒或淺裂；孢子囊群圓形，背生于小脈上；囊群蓋膜質(zhì)，圓形至圓腎形，邊緣疏具鋸齒，大，背面具腺體；孢子橢圓形，周壁具瘤狀突起。氣香，味微苦。見圖2。

2.3顯微鑒別

2.3.1葉柄基部橫切面特征表皮細(xì)胞 1 列，外壁稍厚；厚壁細(xì)胞數(shù)列，基本組織中有分體中柱 3～7 個(gè)，環(huán)狀排列，圓形，中央為木質(zhì)部管胞，多角形，周圍為韌皮部細(xì)胞，外側(cè)1 列束鞘細(xì)胞，內(nèi)皮層明顯。本品葉柄基部橫切面顯微特征見圖3。

圖1　香鱗毛蕨鮮植物圖

圖2　香鱗毛蕨干燥藥材圖

A.橫切面部分詳圖(40×)； B.橫切面全圖(10×)。

圖3香鱗毛蕨葉柄基部橫切面顯微特征圖

Figure 3The micrograph of transverse section ofD.fragrans

2.3.2粉末鑒別本品粉末黃棕色。兩面型孢子，橢圓形，大小為 38 μm×53 μm，周壁具有褶皺，褶皺形成瘤狀突起，外壁厚度約為 2.5 μm，外層厚于內(nèi)層。孢子囊環(huán)帶細(xì)胞，由 14～20 個(gè)增厚細(xì)胞組成，表面觀呈扁長方形。 腺毛頭部為單細(xì)胞，柄部2～3 個(gè)細(xì)胞。單細(xì)胞非腺毛，長而彎曲，壁薄。氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞 3～6 個(gè)。鱗片細(xì)胞排列緊密。梯紋管胞多見，直徑 15～30 μm。木薄壁細(xì)胞長方形，壁薄，紋孔較明顯。纖維單個(gè)散在或成束，直徑 15～23 μm。粉末顯微特征見圖4。

圖4香鱗毛蕨粉末顯微特征圖

Figure 4Micrograph ofD.fragranspowder (40×)

2.4薄層色譜鑒別

取香鱗毛蕨藥材粉末2 g，加入正己烷10 mL，超聲處理15 min，濾過，取濾液5 mL，45 ℃水浴濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取香鱗毛蕨對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取綿馬素BB對(duì)照品，加正己烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照2015版《中國藥典》四部“通則0502薄層色譜法”試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-丙酮-甲酸(體積比20∶1∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈 (254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖5。

1.供試品；2.供試品；3.供試品； 4.對(duì)照藥材； 5.綿馬素BB對(duì)照品。

圖5香鱗毛蕨薄層鑒別圖譜

Figure 5Thin-layer chromatograph ofD.fragrans

2.5檢查與浸出物

水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物的測(cè)定分別參照2015年版《中國藥典》四部“通則0832水分測(cè)定法第二法”“通則2302灰分測(cè)定法”“通則2201浸出物測(cè)定法”進(jìn)行，結(jié)果見表2。

表26批香鱗毛蕨樣品水分、灰分檢查和浸出物測(cè)定結(jié)果

Table 2Examination results ofD.fragrans(n=2)

w/%

2.6總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.6.1對(duì)照品溶液的制備取綿馬素BB對(duì)照品3.5 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解。放置到室溫，定容。再取3 mL，定容至25 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，得到質(zhì)量濃度0.021 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.6.2供試品溶液的制備取香鱗毛蕨粗粉藥材20 g，用400 mL 50%乙醇室溫浸提2次，每次24 h，濾過，合并濾液，測(cè)定濾液體積，取1.5 mL提取液，甲醇定容到50 mL，備用。

2.6.3測(cè)定波長的選擇分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液2 mL，精密加入1.018 mg/mL固藍(lán)B鹽溶液1 mL， 混勻，甲醇定容至10 mL，顯色50 min，在400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)得最大吸收波長為466 nm，故確定為測(cè)定波長。

2.6.4顯色劑用量的考察吸取適量對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶，分別加入1.018 mg/mL固藍(lán)B鹽溶液0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL，于466 nm處測(cè)吸光度。結(jié)果表明：顯色劑用量超過1 mL之后，吸光值趨于穩(wěn)定，故選定顯色劑用量為1 mL。

2.6.5顯色穩(wěn)定性考察吸取適量對(duì)照品溶液，按照上述條件顯色后， 繼續(xù)放置90 min，每隔10 min測(cè)定1次吸光度。測(cè)定結(jié)果表明：顯色后的溶液在50 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為0.107%。

2.6.6線性關(guān)系的考察分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1.018 mg/mL固藍(lán)B鹽水溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置50 min后，以1.018 mg/mL固藍(lán)B鹽作空白參比，按照紫外分光光度法(《中國藥典》四部通則0401)，在466 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，綿馬素BB質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綿馬素BB的線性回歸方程為Y=74.295X+0.012 5 (r=0.998 1)，結(jié)果表明，綿馬素BB在0.002 1～0.010 5 mg范圍內(nèi)與吸光度成良好的線性關(guān)系。

2.6.7精密性試驗(yàn)分別準(zhǔn)確吸取供試品溶液2 mL，共6份，定容至10 mL，按“2.6.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色、測(cè)定，結(jié)果綿馬素BB吸光度的RSD值為0.263%，表明精密度良好。

2.6.8穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液2 mL，按照“2.6.6”項(xiàng)下條件顯色后，繼續(xù)放置90 min，并每隔10 min測(cè)定1次吸光度。結(jié)果表明：供試品溶液顯色后在50 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為1.58%。

2.6.9重復(fù)性試驗(yàn)取6號(hào)香鱗毛蕨粉末6份，每份約20 g，精密稱定，按“2.6.2 ”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.6.6”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，得到RSD值為2.237%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.10加樣回收率試驗(yàn)取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(4.7%～4.8%)的香鱗毛蕨粉末約0. 9 g，共6 份，精密稱定。分別精密加入0.021 mg/mL綿馬素BB對(duì)照品溶液1.7 mL，按“2.6.2 ”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.6”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算回收率，見表3。

表3香鱗毛蕨中綿馬素BB 的加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Table 3Recovery results of aspidin BB inD.fragrans(n=6)

樣品量/g樣品中的量/g加入量/g測(cè)得量/g回收率/%0.90010.036700.035700.0723699.860.89980.036640.035700.0710996.500.90000.036700.035700.0710896.470.90010.036690.035700.0712496.780.89990.036650.035700.0710696.390.89990.036650.035700.0710196.25平均回收率=97.03%,RSD=1.38%

2.7樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

取6批樣品粉末各約20 g，精密稱定，分別按“2.6.2 ”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品平行操作3份。按照“2.6.6”項(xiàng)下方法，自“加入1.018 mg/mL 固藍(lán)B鹽水溶液1 mL”起操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出綿馬素BB的質(zhì)量濃度，計(jì)算。6批樣品(表1中2～7)按干燥品計(jì)算，含總間苯三酚以綿馬素BB計(jì)，分別為(40.77±0.01)、(40.78±0.00)、(40.79±0.01)、(40.76±0.02)、(40.81±0.01)、(40.77±0.01) mg/g，平均值為40.78 mg/g。

3討論

基于對(duì)皮膚癬菌的良好療效，香鱗毛蕨藥材已得到廣泛應(yīng)用。但目前對(duì)香鱗毛蕨的研究主要集中在化學(xué)成分[12]和藥理作用[13]方面，關(guān)于香鱗毛蕨藥材質(zhì)量控制的研究則很少。香鱗毛蕨目前沒有被收載到藥典及地方標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)無相關(guān)的對(duì)照藥材，因此開發(fā)香鱗毛蕨作為新的藥用植物，控制香鱗毛蕨的藥材質(zhì)量顯得尤為重要。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，香鱗毛蕨的薄層鑒別主要采用與對(duì)照藥材比較的方法[7]，缺乏以專屬性成分為指標(biāo)的薄層色譜鑒別。文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]及課題組前期研究[16]都表明香鱗毛蕨中含有大量的綿馬素BB，因此選作薄層色譜定性鑒別成分。

本試驗(yàn)首次采用固藍(lán)B鹽作為顯色劑測(cè)定總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)?？疾炝孙@色劑固藍(lán)BB鹽與固藍(lán)B鹽對(duì)間苯三酚類的選擇性，結(jié)果表明，采用固藍(lán)BB鹽作為顯色劑時(shí)，對(duì)照品與供試品溶液在352 nm處均有吸收峰；不加顯色劑時(shí)，對(duì)照品與供試品溶液在350 nm處也有吸收，故顯色劑使用意義不大，專屬性不明顯。而使用固藍(lán)B鹽作為顯色劑時(shí)，對(duì)照品與供試品溶液在460～480 nm處都有吸收峰，質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，故選用固藍(lán)B鹽。

有文獻(xiàn)報(bào)道鱗毛蕨科植物間苯三酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用綿馬素ABBA作為對(duì)照品[17]。本試驗(yàn)前期研究考察用綿馬素ABBA作為對(duì)照品測(cè)定香鱗毛蕨總間苯三酚類的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果不理想，推測(cè)可能的原因是香鱗毛蕨含有的間苯三酚主要是二環(huán)聚合間苯三酚化合物，用四環(huán)間苯三酚化合物綿馬素ABBA不能準(zhǔn)確測(cè)定。本試驗(yàn)采用從香鱗毛蕨中分離得到成分綿馬素BB作為對(duì)照品，對(duì)于香鱗毛蕨中總間苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定專一性較強(qiáng)。

對(duì)6批香鱗毛蕨藥材的性狀和顯微特征觀察結(jié)果表明，香鱗毛蕨的性狀和顯微特征明顯，專屬性強(qiáng)，可作為其鑒別的依據(jù)；據(jù)檢查項(xiàng)分析得出，標(biāo)準(zhǔn)的制定按各平均值的±20%作為限度，初步限定香鱗毛蕨的水分不得超過12.0%，灰分不得超過12.0%，酸不溶性灰分不得超過2.5%。用熱浸法考察水和醇以及不同體積分?jǐn)?shù)醇的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果熱浸法乙醇浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于水，故浸出物采用乙醇熱浸法測(cè)定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于16.0%?？傞g苯三酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以綿馬素BB計(jì))不得低于32 mg/g。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Study on quality standards ofDryopterisfragrans(L.) Schott

LIU Haiyan,DU Wenzhao,SONG Guoqiang,CHEN Wenhao,YUAN Lipeng,SHEN Zhibin

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To establish quality standards of D. fragrans,and provide scientific evidence for its quality control. Methods The microscopic identification was adopted to observe morphological and histological characters. The contents of water,total ash,acid-insoluble ash and alcohol-soluble extractive were analysed according to the methods of Chinese Pharmacopoeia (2015). Aspidin BB and reference herbs were used to identify materia medica of D. fragrans by TLC method. The total phloroglucinols contents were analysed by UV method with aspidin BB as index. Results The macroscopical identification,microscopic features and TLC methods were specific. The average contents of water,total ash,acid-insoluble ash,alcohol-soluble extract were 9.45%,9.38%,1.58% and 20.8%,respectively,and the content of total phloroglucinols was 40.78 mg/g. Conclusion The established quality standards were suitable for the quality control of D. fragrans.

Key words:D. fragrans; quality standards; aspidin BB; total phloroglucinols; fast Blue B Salt

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015111701

中圖分類號(hào):R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1006-8783(2016)01-0036-05

作者簡介：劉海燕(1990—)，女，2013級(jí)碩士研究生，主要從事中藥及復(fù)方化學(xué)成分研究，Email：gdpu_liuhaiyan@163.com；通信作者：沈志濱(1964—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥及復(fù)方化學(xué)成分研究，Email：szb8113@126.com。

基金項(xiàng)目：廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)(2015B020234009)

收稿日期：2015-11-17

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-15 18:40網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1840.011.html