超高效液相色譜法快速測定復方丹參片中皂苷類成分的含量

吳立蓉，王秀鳳，高衛(wèi)東，唐小婭

(1.廣東藥學院 藥用生物活性物質研究所，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006； 3.佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東 佛山 528000)

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藥物分析

超高效液相色譜法快速測定復方丹參片中皂苷類成分的含量

吳立蓉1，2，王秀鳳2，高衛(wèi)東3，唐小婭2

(1.廣東藥學院 藥用生物活性物質研究所，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學院 基礎學院，廣東 廣州 510006； 3.佛山市食品藥品檢驗檢測中心，廣東 佛山 528000)

摘要:目的 建立超高效液相色譜(UPLC)法測定復方丹參片中4種皂苷成分的質量分數(shù)。方法 采用超高效液相色譜法，色譜柱為Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為0.5 mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫為30 ℃。結果 復方丹參片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1在12 min內獲得完全分離。各成分在定量范圍內均呈良好的線性關系(r≥0.999)，平均回收率為98.9%～102.2%。結論 UPLC法與HPLC法同時測定同一批樣品，測得的質量分數(shù)結果RSD值為0.01%。UPLC法提高了常規(guī)液相分析三七皂苷的速度，節(jié)約了溶劑。

關鍵詞:超高效液相色譜法； 復方丹參片； 皂苷

超高效液相色譜(UPLC)法近年來作為一種新技術，與傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)法相比，具有檢測快速、高靈敏度、高分離度的優(yōu)點，可大大縮短分析時間，同時減少溶劑用量以降低分析成本，目前在藥物分析、生化分析、食品及環(huán)境分析等領域應用較廣。

復方丹參片由丹參、三七、冰片3味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，《中國藥典》法定測定其中4種皂苷類成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的質量分數(shù)采用普通高效液相色譜法，耗時100 min，分析時間長、效率低[1]。有文獻報道采用UPLC法測定復方丹參片中3種皂苷類成分的質量分數(shù)[2]，但是按照《中國藥典》規(guī)定[1]，只3種成分的測定無法用于復方丹參片在生產(chǎn)流通過程中的質量控制,無實際應用價值。因此本研究參照文獻[3-5]，采用UPLC法測定復方丹參片中4種皂苷類成分的質量分數(shù)，約10 min可以完成整個測定過程，極大地縮短了時間，提高了分析效率，可以在藥品生產(chǎn)過程中產(chǎn)品質量控制以及藥品流通過程中監(jiān)督檢驗等方面產(chǎn)生較大的經(jīng)濟與社會效益。

1儀器與試藥

Waters Acquity UPLC系統(tǒng)(四元泵處理器、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器)；Millipore超純水機(美國默克密理博公司)。

三七皂苷R1(批號：110745-200414)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201128)、人參皂苷Re(批號：110754-201123)、人參皂苷Rb1(批號：110704-201122)對照品購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純(Merck公司)，水為超純水。

復方丹參片(云南白藥集團股份有限公司，批號：3140918)。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)； 流動相：乙腈-水，梯度洗脫；流速：0.5 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。梯度洗脫程序見表1，色譜圖見圖1，各成分分離度皆大于1.5。

表1復方丹參片中4種皂苷類成分測定的梯度洗脫表

Table 1Gradient elution of four components in compound Salvia tablets

t/minφ(乙腈)/%φ(H2O)/%0.00～2.0082.018.02.00～5.0082.0→80.018.0→20.05.00～11.0080.0→60.020.0→40.011.00～11.1060.0→82.040.0→18.011.10～12.0082.018.0

AB0.080.060.040.020.000.080.060.040.020.0043211234024681012t/minAUAU

1.三七皂苷R1； 2.人參皂苷Rg1； 3.人參皂苷Re； 4.人參皂苷Rb1。

圖1混合對照品(A)、復方丹參片供試品(B)溶液的UPLC色譜圖

Figure 1UPLC chromatograms of mixed references(A) and compound Salvia tablets(B)

2.2混合對照品溶液的制備

精密稱取對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1適量，加70%(體積分數(shù)，下同)甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1分別為0.050、0.200、0.051、0.202 mg的混合對照品溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備

取復方丹參片10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量。超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關系的考察

分別精密稱取對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1適量，加70%甲醇制成每1 mL含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1分別為0.20、0.40、0.20、0.40 mg的混合對照品溶液，備用。精密量取上述對照品混合溶液各1、2、4、6、8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度。分別精密吸取1 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，每個樣品進樣2次。以對照品質量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標進行線性回歸，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的回歸方程分別為Y1=6.120 08×105X1+3.619 1×102，r1=0.999 5；Y2= 5.912 95×105X2+1.492 2×102，r2=0.999 9；Y3= 6.867 12×105X3-1.415 7×102，r3=0.999 7；Y4=5.081 59×105X4+9.619 1×102，r4=0.999 9。結果表明4種皂苷類成分進樣量分別在0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg、0.02～0.16 μg、0.04～0.32 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下條件重復測定5次，分別計算4種成分的峰面積積分值。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為0.09%、0.04%、0.08%、0.04%，表明儀器精密度良好。

2.6重復性試驗

取同一批(批號：3140918)復方丹參片，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，共5份，每份平行測定2次，按“2.1”項下條件測定并計算各成分的質量分數(shù)。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質量分數(shù)的RSD值分別為1.13%、0.95%、1.01%、1.00%。

2.7穩(wěn)定性試驗

取同一批(批號：3140918)供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，按“2.1”項下測定并計算各成分峰面積的RSD值，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為0.40%、0.15%、0.37%、0.25%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗

取復方丹參片粉末6份，每份約0.5 g，精密稱取，加入三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質量濃度分別0.25、1.0、0.1、0.8 mg/mL的混合對照品溶液1 mL，按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下測定并計算回收率。結果測得回收率為98.85%～102.24%，RSD值為1.12%～1.99%。見表2。

2.9UPLC法與HPLC法測定結果的統(tǒng)計分析

取復方丹參片樣品適量，分別按上述UPLC法與HPLC法[1]測定其中4種皂苷類成分的總質量分數(shù)，平行測量7次。測定結果見表3。

表2　復方丹參片中4種皂苷類成分的回收率試驗結果

表3UPLC法與HPLC法測定復方丹參片中4種皂苷類成分總質量分數(shù)的結果比較

Table 3Determination results of four saponins with UPLC and HPLC in compound Salvia tablets

w/(mg·g-1)

采用兩樣本均值間的t檢驗進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)公式：

(1)

(2)

計算，得t=0.431。查t檢驗臨界值表得知，雙側檢驗t0.05,10=2.228，t

3討論

為保證與《中國藥典》規(guī)定的一致性，本試驗的供試品溶液提取方法、測定波長與藥典規(guī)定一致，同時考察了色譜條件的流動相組成、柱溫和流速等。用所建立的UPLC法測定復方丹參片中各成分質量分數(shù)，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，符合藥典要求。

比較了UPLC法與HPLC法所測樣品質量分數(shù)的數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計分析得知，這2種分析方法所測得的均值差異無統(tǒng)計學意義，因此可用UPLC法替代HPLC法測定復方丹參片中4種皂苷類成分的質量分數(shù)。

與藥典增補方法需要的100min相比，本UPLC法極大地縮短了時間，提高了分析效率，在12min內即可將復方丹參片中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb14種待測成分完全分離，可以代替常規(guī)HPLC法進行測定，在藥品生產(chǎn)過程產(chǎn)品質量控制以及藥品流通過程監(jiān)督檢驗等方面產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益和社會效益。

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版第一增補本[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：201-202.

[2] 羅峰，崔永霞，沈曉明，等.超高效液相色譜法測定復方丹參片中三種皂苷類成分的含量[J].中醫(yī)學報,2015,30(4):551-553.

[3] 謝耀軒,林亞珠.超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].廣東藥學院學報,2011,27(5):489-492.

[4] 姜濤,陳林明,林岱濱.超高效液相色譜法測定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的方法研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用,2014，8(20):15-16.

[5] 吳健,高家榮,吳小明,等.超高效液相色譜法同時測定復方守宮散中皂苷類含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2014,34(8):647-649.

(責任編輯：劉曉涵)

Simultaneous determination of four components in compound Salvia tablets by UPLC analysis

WU Lirong1，2,WANG Xiufeng2,GAO Weidong3,TANG Xiaoya2

(1.InstituteofPharmaceuticalBioactiveSubstanceResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;3.FoshanCenterforFoodandDrugControl，F(xiàn)oshan528000，China)

Abstract:Objective To develop a novel and rapid method with ultra-performance liquid chromatography for the simultaneous determination of four saponins in compound Salvia tablets. Methods An acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) was used. Acetonitrile and water were adopted with gradient elution of 0.5 mL/min,and the detection wavelength was 203 nm. The column temperature was 30 ℃. Results Notoginsenoside R1 and ginsenoside Rg1,Re and Rb1 in compound Salvia tablets had good linearity. And the average recoveries were among 98.9%-102.2% (n=6). Conclusion The relative deviation of the content was 0.01% when UPLC and HPLC was used to determine the same sample. UPLC could greatly improve the separation efficiency and reduce the solvent consumption. As an alternative of conventional HPLC,UPLC is more convenient,rapid and feasible.

Key words:UPLC； compound Salvia tablets；saponins

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110201

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0032-04

作者簡介：吳立蓉(1980—)，女，博士，副研究員，主要從事中藥復方抗衰老及藥品質量標準的研究，Email：30872950@qq.com；通信作者：唐小婭(1980—)，Email：526325348@qq.com。

基金項目:國家自然科學基金項目(81403153)；廣東省省級科技計劃項目(2014A020212603)

收稿日期：2015-11-02

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-15 18:36網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1836.010.html