蛇床子素脂質體凝膠劑的制備及其體外透皮試驗的初步研究

賴瀅瀅，周若鵬，張英豐，王巖

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州奇績醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663；3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

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蛇床子素脂質體凝膠劑的制備及其體外透皮試驗的初步研究

賴瀅瀅1，周若鵬2，張英豐3，王巖1

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州奇績醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663；3.廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 制備蛇床子素脂質體凝膠劑，并對其體外滲透量及皮膚貯庫效應進行考察。方法 采用薄膜分散法制備蛇床子素脂質體，再以卡波姆-940為基質制備脂質體凝膠劑；采用Franz擴散池法進行體外透皮試驗，以高效液相色譜法測定蛇床子素的累積滲透量，通過藥物的透皮給藥吸收來評價蛇床子素脂質體凝膠劑的性能。結果 蛇床子素脂質體凝膠劑的滲透行為符合Higuchi方程，其中24 h的皮膚累積滲透量達到172.95 μg/cm2，貯庫后的皮膚累積滲透量達到210.19 μg/cm2。結論 蛇床子素脂質體凝膠劑可透過皮膚被吸收，具有長效緩釋作用，為研制蛇床子素的新型透皮制劑奠定了基礎。

關鍵詞:蛇床子素； 脂質體凝膠劑； 體外透皮吸收試驗

自20世紀80年代以來，脂質體因能很好地模擬生物膜脂質雙層結構，并具有生物膜的流動性，一直被作為生物膜模型而受到廣泛重視并應用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)中[1]。脂質體在表皮和真皮內(nèi)可形成藥物貯庫，使最大量的包封物保留在皮膚中，發(fā)揮長效緩釋作用。凝膠劑是將藥物與適宜基質制成的具凝膠特性的經(jīng)皮給藥半固體或稠厚液體制劑，質地均勻細膩，展開后易于涂布在皮膚上形成透明的薄膜，滯留時間長，無氣悶油膩感，對皮膚和黏膜無刺激性[2]，為皮膚局部外用的常用制劑。近幾年，國內(nèi)外研究者對一系列的新型經(jīng)皮吸收藥物載體進行了研究，將脂質體分散在凝膠基質中制備成脂質體凝膠劑，形成多貯庫型系統(tǒng)，可有效控制藥物釋放的速度，通過凝膠良好的黏附性降低脂質雙分子的流動性，防止藥物滲出脂質體，增加脂質體的穩(wěn)定性，發(fā)揮長效緩釋作用，從而降低藥物不良反應，減少用藥次數(shù)，提高生物利用度。

蛇床子及其復方制劑為治療銀屑病[3]和濕疹[4]等病的常見中草藥，其有效成分為蛇床子素，但由于蛇床子素難溶于水[5]、生物利用度低[6]等性質，使得真正把蛇床子素作為一種藥物應用于臨床的并不多見。本文在前期完成蛇床子素脂質體制備工藝的基礎上[7]，進一步制備了蛇床子素脂質體凝膠劑，并考察蛇床子素的體外透皮情況，為蛇床子素新劑型的后期研究與開發(fā)提供理論基礎。

1儀器與試藥

1.1儀器

LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；WFZ UV-2100型紫外-可見光光度儀(上海尤尼柯儀器有限公司)；RE-20000旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化試劑廠)；TG1650-WS臺式高速離心機(上海盧湘儀機電設備有限公司)；SK3300LH超聲波清洗器(上?？茖С暡▋x器有限公司)；AUY-220型、AUW-220D型分析天平(廣州儀通興儀器儀表有限公司)；雷磁PHS-25 pH計(上海精科實業(yè)有限公司)；YK-12D透皮擴散實驗儀(上海鍇凱科技有限公司)。

1.2試藥及原料藥

蛇床子素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110822-201308，質量分數(shù)：98%)；蛇床子素原料藥(南京澤朗生物科技有限公司，批號：ZL20131220JZS，質量分數(shù)：98%)；大豆卵磷脂(上海藍季生物有限公司)；膽固醇(上海潤捷化工試劑有限公司)；聚山梨酯-80(廣州化學試劑廠)；Sephadex G-25葡聚糖凝膠(上海藍季生物有限公司)；卡波姆-940(青島天力源生物科技有限公司)；吐溫80(廣州化學試劑廠)；三乙醇胺(廣州化學試劑廠)；Na2S(天津市大茂化學試劑廠)；生理鹽水(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院)；NaH2PO4(廣州化學試劑廠)；Na2HPO4(廣東省化學制劑工程技術研究開發(fā)中心)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3動物

昆明種雄性小鼠5只，體質量18～20 g,中山大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(粵)2012-0125。

2方法與結果

2.1蛇床子素脂質體及蛇床子素脂質體凝膠劑的制備

精密稱取蛇床子素原料藥10 mg、大豆卵磷脂、膽固醇、三氯甲烷適量(藥物和磷脂質量比為1∶22.66，磷脂與膽固醇的質量比為4∶1，磷脂質量濃度為24.93 mg/mL)于150 mL圓底燒瓶中，超聲溶解后，40 ℃減壓旋轉蒸發(fā)除去溶劑，然后加入含有質量分數(shù)1.67%吐溫80的PBS水溶液(pH值為6.5)10 mL，50 ℃下常壓旋轉洗膜30 min后渦旋1 min，得到均勻無黏塊的白色混懸液即為蛇床子素脂質體溶液[7]。經(jīng)前期研究確定蛇床子素脂質體的優(yōu)化處方并制備3批脂質體，測得包封率分別為93.12%、96.51%、95.17%，平均包封率為94.93%，RSD為1.8%。

取蛇床子素脂質體混懸液10 mL，加入卡波姆0.2 g，攪拌均勻，溶脹過夜后攪勻，用三乙醇胺調節(jié)pH為6.0～6.5后，加PBS水溶液(pH值為6.5)至20 g，攪拌均勻，放置數(shù)小時，使卡波姆940溶脹呈透明均質狀態(tài)，即得到蛇床子素脂質體凝膠劑(蛇床子素質量分數(shù)約為0.05%)。同法制備空白脂質體凝膠劑。

2.2測定方法的建立

2.2.1色譜條件Hypersil ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為甲醇-水(體積比75∶25)，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫，檢測波長為322 nm，進樣量為10 μL，分別取蛇床子素對照品溶液、蛇床子素脂質體凝膠透皮后的樣品溶液以及空白脂質體凝膠透皮后的空白溶液進樣。結果表明：蛇床子素的相對保留時間為6.7 min左右，皮膚內(nèi)源性成分對蛇床子素的檢測無明顯干擾，見圖1。

2.2.2標準曲線的繪制精密稱取干燥至恒質量的蛇床子素對照品10.01 mg，置10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，即得質量濃度為1.001 mg/mL的對照品溶液。取對照品溶液并用流動相稀釋成質量濃度分別為5.005、15.015、30.03、50.05、60.06、75.075 μg/mL的系列對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過,各精密吸取10 μL注入色譜儀，以峰面積對質量濃度進行線性回歸，得回歸方程y=4.306×104x-2.298×104,r=0.999 7。結果表明，蛇床子素質量濃度在5.005～75.075 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

BAC43210-110501050mAUmAUmAU0.02.55.07.510.0t/min

A.對照品溶液； B.樣品溶液； C.空白溶液。

圖1蛇床子素脂質體凝膠的高效液相色譜圖

Figure 1Chromatograms of osthole liposome gel

2.2.3精密度考察和相對回收率試驗取“2.2.2”項下15.015 μg/mL對照品溶液，在1天內(nèi)連續(xù)進樣5次，同時在連續(xù)5 d內(nèi)每天進樣1次，考察日內(nèi)精密度和日間精密度,結果對照品溶液的日內(nèi)RSD為0.63%，日間RSD為1.11%，表明儀器精密度良好。分別定量稱取含蛇床子素脂質體質量分數(shù)為80%、100%、120%的凝膠各10 g，加入空白脂質體凝膠5 g，進行相對回收率試驗，結果3種質量濃度溶液的平均相對回收率為101.96%,RSD為2.33%。

2.3蛇床子素脂質體凝膠劑的初步評價

2.3.1性狀本品為淺黃色透明凝膠,質地均勻細膩。

2.3.2酸堿度檢查分別取3批脂質體凝膠樣品1 g，置于燒杯中,加入蒸餾水10 mL稀釋后,攪拌5 min,測得pH值為6.0～6.5。

2.3.3離心試驗分別取3批脂質體凝膠樣品置于帶刻度的離心管中,于5 000 r/min離心30 min,結果顯示凝膠均無分層現(xiàn)象。

2.3.4耐熱、耐寒試驗分別取3批凝膠樣品，置55 ℃恒溫箱中8 h，于冷凍下放置24 h，取出融化后再于冷凍下放置24 h，如此重復3次，結果顯示凝膠均無分層變色現(xiàn)象。

2.3.5皮膚刺激性試驗取1只健康大白鼠，剔去背部毛，選4塊完整皮膚分別涂上蛇床子素脂質體凝膠3批樣品，另一塊做空白對照，用醫(yī)用紗布裹好，24 h后，拆開觀察，結果顯示均無紅腫現(xiàn)象。

上述結果提示，以卡波姆-940為基質的優(yōu)化處方制備的蛇床子素脂質體凝膠具有較好的穩(wěn)定性和安全性。

2.4體外透皮試驗

2.4.1離體鼠皮的制備取同一牢籠并飼養(yǎng)一個月后體質量為18～20 g的健康大鼠，麻醉后用剪刀除盡胸腹部毛,再用質量分數(shù)6%Na2S溶液將大鼠胸腹部脫毛，立即剝離胸腹部皮膚，剔除皮下組織和脂肪，注意操作過程中不可損壞角質層。以生理鹽水漂洗干凈，將上述皮膚平鋪在錫箔紙上并包封完全，-20 ℃冷藏，備用。臨用前置生理鹽水中解凍，并確保鼠皮的完整性。

2.4.2體外透皮試驗方法將制備好的新鮮鼠皮角質層向上固定在Franz擴散池上，維持溫度(37±1)℃，接受室內(nèi)裝乙醇-生理鹽水(體積比30∶70)作為接收液，并確保接受室中無氣泡，皮膚固定在供給室和接受室之間，皮膚表皮層面向供給室，并且保持真皮層與溶液密切接觸。擴散池的有效滲透面積(A)為3.14 cm2，接受室體積(V)為8 mL。取一定量的脂質體凝膠均勻涂布于皮膚表面，將接收池置于(37±1) ℃的恒溫水浴中，開啟電磁攪拌器以200 r/min的速度攪拌,于 1、2、4、6、8、12、24 h間隔取樣4 mL，置于5 mL量瓶中，同時立即補充等體積同溫度的接收液。以甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液注入高效液相色譜儀，測定。

離體經(jīng)皮滲透試驗停止后,取下皮膚,除去皮膚上殘余的凝膠,用生理鹽水洗凈殘留的樣品,用濾紙吸干水分，按前述步驟進行皮膚貯庫試驗。

將所測得的峰面積代入回歸方程，求出藥物濃度，并按以下公式計算單位面積累積滲透量(Q)：

Q=(CnVn+ΣCiVi)/A，

式中：Q為單位皮膚累積滲透量，Cn為第n次取樣時接收液的濃度，Ci為第i個取樣點濃度，Vn為接受池容積，Vi為取樣量體積，A為擴散面積。

以累積滲透量(Q)為縱坐標，時間(t)為橫坐標，繪制24 h的體外經(jīng)皮滲透曲線，見圖2。

250200150100500Q/(μg?cm-2)101520253005t/h透皮吸收試驗貯庫效應試驗

圖2蛇床子素脂質體凝膠的24 h體外經(jīng)皮滲透曲線

Figure 2The absorption curves of osthole liposome gel within 24 hours(n=6)

以單位面積累積滲透量(Q)對時間(t)分別進行零級、一級、Higuchi方程擬合，直線的斜率即為透皮速率常數(shù)(J)，以相關系數(shù)r為方程擬合的判斷標準，結果表明Higuchi方程擬合結果較好。蛇床子素脂質體凝膠劑0～24 h的透皮吸收回歸方程為Q1=46.034t1/2-44.515，r=0.986 6,滲透速率為46.034 μg/h，24 h后的皮膚累積滲透量達172.95 μg/cm2。貯庫效應試驗的回歸方程為Q2=48.155t1/2-12.03，r=0.986 6,滲透速率為48.155 μg/h，24 h后的皮膚累積滲透量達210.19 μg/cm2。

3討論

體外透皮試驗在經(jīng)皮制劑處方篩選及相關影響因素考察等方面有重要應用價值，選擇合理的體外透皮試驗條件是準確反映藥物透皮吸收特征的前提之一[8]。常用的透皮接收液為生理鹽水、磷酸鹽緩沖液,但對于脂溶性藥物，接收液對藥物的溶解性能很小，很快就達到飽和濃度而難以達到漏槽條件[8]，故需加入一定濃度的乙醇來增加藥物溶解度。研究表明，由于蛇床子素為脂溶性藥物[5]，乙醇濃度越高，經(jīng)皮給藥速率越快，但乙醇濃度過高時，會導致接收液揮發(fā)加快，而且還會對皮膚正常的生理結構產(chǎn)生一定的影響[8]，經(jīng)前期考察，本文確定以生理鹽水-乙醇溶液(體積比70∶30)為接受液。由于人體內(nèi)部溫度是37 ℃，故本文選擇此溫度為試驗溫度。由于擴散池容積和接收液用量固定，本課題組以往研究表明，轉速在100～200 r/min之間，藥物的透皮速率常數(shù)和累積滲透量并無明顯差異[9]，因此本文將轉速確定為200 r/min。

蛇床子素是香豆素類化合物,不易溶解在水中,卡波姆凝膠又具有生物親和性,而脂質體和皮膚為磷脂雙分子層,使蛇床子素從脂質體凝膠制劑中擴散出來,透過小鼠皮膚進入到吸收池中[10]。將蛇床子素制備成蛇床子素脂質體凝膠劑作用于皮膚,能有效地治療皮膚疾病。卡波姆-940作為凝膠劑基質用于經(jīng)皮給藥具有易涂布、易水洗、無皮膚毒性、可吸收汗腺分泌物等特點[11]，是一種較理想的經(jīng)皮給藥基質，可有效提高藥物的滲透性，使藥物起到有效緩釋作用。本文結果表明,蛇床子素脂質體凝膠的累積滲透量隨著時間的增加而增大，從經(jīng)皮滲透曲線來看，猜測透皮試驗結束后，有部分蛇床子素貯存在皮膚中，從而導致貯庫試驗中蛇床子素的滲透率和皮膚累積滲透量增高，初步判斷蛇床子素脂質體凝膠劑有貯庫作用，從趨勢上來看，2次試驗的模型基本保持一致，且10～24 h達到穩(wěn)態(tài)，提示制備體外透皮制劑時可以做成緩釋制劑。蛇床子素脂質體凝膠劑對藥物有緩釋作用,既能提高藥物的安全性，又可延長藥物作用時間，提高藥效。以上研究為蛇床子素脂質體凝膠的開發(fā)提供了依據(jù)，為擴大其臨床應用提供了新思路。

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(責任編輯：陳翔)

Preparation of osthole liposome gel and preliminary study on itsinvitrotransdermal experiments

LAI Yingying1,ZHOU Ruopeng2,ZHANG Yingfeng3,WANG Yan1

(1．SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangzhouKeygenesMedicineSci&TechCompanyLimited，Guangzhou510663，China；3.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To prepare the osthole liposome gel and evaluate the skin storage effect and the cumulative penetration in vitro. Methods The osthole liposomes were prepared by using the thin film dispersion method, and the Carbopol-940 was added as matrix for the preparation of the osthole liposome gel. In vitro transdermal experiments were done by Franz diffusion pool method. The cumulative release of osthole was determined by HPLC method to evaluate the drug absorption performance of osthole liposome gel. Results The absorption curve of osthole liposome gel was consistent with Higuchi function. The cumulative penetration of osthole liposome gel in 24 hours was 172.95 μg/cm2 in vitro transdermal experiments，while the cumulative penetration was 210.19 μg/cm2 in skin library storage experiments. Conclusion Osthole liposome gel can be absorbed through the skin with long-acting slow-release effect, and this experiment can provide a reference for the development of osthole transdermal preparations.

Key words:osthole; liposome gel; in vitro transdermal experiment

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110203

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0005-04

作者簡介：賴瀅瀅(1990—)，女，2013級碩士研究生，Email:609621147@qq.com;通信作者：王巖(1972—)，男，碩士生導師，教授，從事藥物新劑型與新技術研究，Email:gdpuwy@126.com。

收稿日期：2015-11-02

網(wǎng)絡出版時間：2016-01-18 9:42網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160118.0942.001.html