貴州煙田非煙植物和煙草白粉病菌的RAPD分析

黃 團，范成平，盧志偉，左 銳

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006；3.貴州省煙草公司安順市公司，貴州安順561000；4.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴州貴陽550000）

貴州煙田非煙植物和煙草白粉病菌的RAPD分析

黃 團1，2，范成平3，盧志偉4，左 銳2

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色533000；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006；3.貴州省煙草公司安順市公司，貴州安順561000；4.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，貴州貴陽550000）

為確定煙田非煙植物的白粉病菌能否浸染煙草，并分析煙田植物與煙草白粉病菌間的親緣關(guān)系，收集煙田及周邊非煙植物與煙草的13份白粉病菌，利用RAPD技術(shù)對其進行分子標記分析，并通過人工接種鑒定其浸染能力。結(jié)果表明：參試的11份材料相似系數(shù)為0.030 8～0.720 9，多樣性較豐富，其對煙草的致病能力變化也較大；根據(jù)多態(tài)性，11份材料中地雷花、水蛇麻與煙草白粉病菌歸為一類，親緣關(guān)系較近，且容易浸染煙草，白粉病菌間的多態(tài)性與浸染能力存在一定的相關(guān)性。

非煙植物；煙草；白粉病菌；分子標記

煙草作為一種特殊的消費品，是我國的主要經(jīng)濟作物，近年來種植面積和產(chǎn)量均居世界前列［1］。在減少有害成分、保障大眾健康的基礎(chǔ)上，煙葉質(zhì)量的控制非常重要。煙草白粉病使煙葉缺乏彈性、組織壞死，降低甚至失去烘烤價值［2］，是嚴重影響煙葉質(zhì)量的主要病害之一，其不僅能浸染煙田煙株，還能浸染收獲后堆放、烘烤的煙葉［3－5］。目前，主要通過白粉病菌菌株在鑒別寄主上的抗感反應(yīng)［6－7］判斷白粉病菌所屬生理小種，也有通過結(jié)合ITS、RAPD等分子標記手段［811］進行鑒定，或根據(jù)基因組中特有保守序列設(shè)計引物鑒定［12］；這些工作多以某種或某類作物［13－14］所浸染的白粉病菌為對象。而在生產(chǎn)過程中，煙田及周邊存在的多種非煙作物及雜草也是白粉病菌的主要攜帶植物［15］，其攜帶的白粉病菌是否會浸染煙草及白粉病菌間的親緣關(guān)系未見相關(guān)報道。因此，對貴州貴陽及安順煙田中煙株及其非煙作物和雜草上收集的白粉病菌，進行人工接種浸染能力試驗和RAPD分子標記技術(shù)，探討不同非煙植物與煙草白粉病菌間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，同時初步建立白粉病菌分子檢測技術(shù)和方法，為白粉病菌不同生理小種的鑒定及煙草白粉病的防治提供試驗及分子學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草品種為南江3號，由貴州省煙草公司安順市公司提供。

白粉病菌采集自貴州安順、貴陽周邊煙田中的煙株、雜草及附近農(nóng)作物上自然發(fā)病植株，植物包括羊蹄、洋姜、大豆、煙草、西紅柿、水蛇麻、風(fēng)輪菜、地雷花、葵花、土荊芥、指甲花、南瓜和黃瓜等13種。

試劑主要有Tiangen公司產(chǎn)的Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer和100bp DNA ladder，上海生工生物工程公司產(chǎn)的dNTPs。選用的20條隨機引物（表1）長度為10bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 人工接種白粉病菌試驗

試驗在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進行。煙苗用花缽栽培，每缽1株，到煙苗生長至5葉時，選擇未發(fā)病、長勢均勻的煙苗接種白粉病菌。每種非煙作物或雜草上的病菌接種1株煙苗，每株接4片葉，1片接種煙草白粉病菌（CK），其余3片接種需要鑒定的非煙植物白粉病菌，每片葉接種6個點，重復(fù)3次。白粉病菌采用菌液法接種：將供試病菌用無菌水洗下，鏡檢計數(shù)后稀釋成106個／mL濃度的孢子懸液，滴在煙葉上表面，每個點每次接種1滴菌液，待第1次接種的菌液干后再滴第2滴，每滴菌液25uL，共50uL。接種后用干凈透明的薄膜單株間隔開，置于溫室大棚內(nèi)，保持小空間內(nèi)的溫度和濕度，形成促進病菌孢子萌發(fā)的陰涼潮濕環(huán)境［5］。第2周開始，每周觀察、記錄病菌在葉片上的生長情況，直至第6周；根據(jù)存活率及存活時間判斷其浸染能力。

1.3 基因組DNA提取及測定

在煙田非煙植物白粉病發(fā)病時，輕掃感病葉片表面白粉病菌，收集至1.5mL尖底離心管，置于－20℃保存；在提取各病菌的DNA時，每離心管加入少量磨細的無菌石英砂和約50uL提取液，用研磨棒磨碎樣品后，參考改進的CTAB法［16］；1.0%的瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計DU800Spectrophotometer檢測DNA純度和濃度。

1.4 RAPD擴增、產(chǎn)物檢測及分析

試驗在百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室及貴州省生物技術(shù)研究所進行。經(jīng)過優(yōu)化后，確定了煙草白粉病菌的RAPDPCR反應(yīng)體系為10×PCR buffer（含20μmol／L的Mg2＋）2.5μl，10mmol／L的dNTPs 0.5μL和10μmol／L的隨機引物1μL，Taq DNA聚合酶0.75U，模板DNA 50ng，最后補足dd H2O至25 μL。在BIO－RAD的T100型PCR儀上進行擴增。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性4min；95℃變性45s，36℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃延伸8min；擴增后，產(chǎn)物保存于4℃冰箱中。最后，利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察、保存。

統(tǒng)計凝膠電泳圖譜上重復(fù)性好、有差異且易識別的多態(tài)性條帶，在相同遷移率的位置上，有帶記為1，無帶記為0，組成1和0的原始矩陣。采用NTSYS－pc 2.10e軟件對煙田11種不同非煙植物的白粉病菌進行分析，采用UPGMA方法進行聚類，并通過Treeplot生成聚類圖，綜合人工接種試驗及分子標記聚類分析白粉病菌的親緣關(guān)系及致病性。

表1 試驗所用引物的序列Table1 The sequences of primers in test

表2 13個不同寄主的白粉病菌對煙株的浸染效果Table2 Infection results of powdery mildew fungus from 13different hosts to tobacco

2 結(jié)果與分析

2.1 煙田非煙植物白粉病菌對煙草的浸染能力

表2結(jié)果表明，采自煙田及周邊的部分非煙作物和雜草的白粉病菌能夠侵染煙株，侵染能力強弱依次為地雷花＞風(fēng)輪菜＞葵花＞水蛇麻＞羊蹄，且與對照（煙草）有明顯差異。因此，初步認為煙田及周邊的地雷花、風(fēng)輪菜、葵花、水蛇麻和羊蹄所攜帶的白粉病菌可能在栽培過程中成為煙草的白粉病的侵染源。而南瓜、黃瓜、洋姜、大豆、西紅柿、土荊芥和指甲花植株上的白粉病菌對煙草的侵染能力較差，可能不侵染煙草植株。

2.2 病菌基因組DNA的提取情況

1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）表明，除大豆、風(fēng)輪菜的白粉病菌提取效果不佳外，其它白粉病菌基因組DNA主帶清晰，完整、無降解，RNA消化徹底；紫外分光光度計測定A260／A280值在1.7～1.9，表明所提取的白粉病菌DNA純度較高，質(zhì)量能滿足RAPD分子標記對DNA模板的要求。

圖1 部分白粉病菌基因組DNA瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果Fig.1 The tested result of powdery mildew fungus genome DNA by Agarose gel electrophoresis

圖2 白粉病菌RAPD引物擴增結(jié)果Fig.2 The amplification pattern of powdery mildew fungus amplified by RAPD primers

圖3 11份白粉病菌RAPD的聚類結(jié)果Fig.3 Clustering diagram of 11isolates of powdery mildew fungus by UPGMA（RAPD）

2.3 白粉病菌RAPD－PCR擴增多態(tài)性

利用篩選的引物對參試材料病菌進行的RAPD－PCR擴增結(jié)果（圖2）表明，20條參選RAPD引物中，篩選的14條引物能擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，多態(tài)性引物比例為70%；在11個不同寄主（除風(fēng)輪菜外）的白粉病菌中總共擴增出多態(tài)性位點167個；多態(tài)性引物最多擴增出17條多態(tài)性條帶，最少8條；平均每條引物擴增出11.9個多態(tài)性位點。由此可知，參試材料間具有較大遺傳差異，遺傳多樣性較豐富。大豆、風(fēng)輪菜的白粉病菌RAPD擴增效果不佳，在部分引物中模糊甚至不出現(xiàn)條帶，故不計統(tǒng)計分析。

表3 11個寄主白粉病菌浸染能力間的相似系數(shù)Table3 The coefficient of 11isolates of powdery mildew fungus

2.4 白粉病菌的聚類結(jié)果

聚類分析結(jié)果（圖3）表明，11份參試白粉病菌間的相似系數(shù)在0.030 8～0.720 9，差異大；以相似系數(shù)0.20可將11種不同白粉病菌分為4類（圖3）。第一類為洋姜白粉病菌，其與煙草白粉病菌相似系數(shù)為0.164 4；第二類包括煙草、地雷花和水蛇麻的白粉病菌；第三類包括葵花、黃瓜、南瓜及指甲花的白粉病菌，其中，指甲花和南瓜、黃瓜三者的白粉病菌相似系數(shù)較高，分別為0.7209和0.6897（表3）；第四類為羊蹄、西紅柿和土荊芥的白粉病菌。參試的11種植物白粉病菌同一大類間的親緣關(guān)系較近，在遺傳基礎(chǔ)上，地雷花、水蛇麻白粉病菌與煙草白粉病菌的親緣關(guān)系較近，歸入第二大類；而煙田非煙植物白粉病菌對煙草的人工浸染能力的鑒定（表3）表明，煙田及周邊水蛇麻和地雷花植株感染的白粉病菌容易浸染煙田煙草；單葉第二大類材料的分析，白粉病菌間的親緣關(guān)系與浸染能力存在相關(guān)性。但羊蹄和葵花白粉病菌與煙草在親緣關(guān)系上并不歸為一類，而人工接種的浸染能力表明其對煙草具有浸染能力。因此，初步認為白粉病菌間的親緣關(guān)系與浸染能力可能存在一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

在常規(guī)的白粉病生理小種鑒定方法中，植株的抗感反應(yīng)受到接菌時期、菌樣濃度及純度、鑒別寄主的種植環(huán)境、接種后環(huán)境等條件影響，可導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準確。白粉病菌生理小種鑒定方法雖有一套通用的鑒別寄主和抗感反應(yīng)，但鑒別寄主對病菌的抗感判斷卻沒有統(tǒng)一標準，接種條件也無明確規(guī)定［11］。因此，人工接種浸染煙草的鑒定試驗的規(guī)范操作是試驗順利進行的保證?；贒NA水平的RAPD分子標記在鑒定白粉病菌可以避免環(huán)境條件的影響，其結(jié)果更可靠；同時，RAPD技術(shù)簡單、操作簡便、多態(tài)性高，已廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)分類、資源多樣性鑒定等研究［1720］。

本研究通過人工接種試驗結(jié)合RAPD分子標記對煙草及煙田非煙植物白粉病菌進行親緣關(guān)系鑒定，以此判斷煙田非煙植物所攜帶的白粉病菌會否浸染煙草，同時通過聚類分析歸類白粉病菌，初步認定煙草、地雷花和水蛇麻的白粉病菌親緣關(guān)系較近；結(jié)合煙田非煙植物白粉病菌對煙草的人工接種的浸染能力鑒定結(jié)果，即地雷花、水蛇麻植株上的白粉病菌在浸染煙草葉片的第6周平均成活率分別為50%和22.22%，判斷地雷花、水蛇麻植株上的白粉病菌容易浸染煙田的煙草。因此，在進行煙田煙草白粉病防治時，應(yīng)該注重?zé)熖锛案浇呗楹偷乩谆ò追鄄〉陌l(fā)生情況，及時采取措施，防止其侵染煙草，從源頭遏制白粉病的發(fā)生和蔓延。羊蹄和葵花的白粉病菌雖在RAPD分子標記親緣鑒定上與煙草不聚為一類，但對煙草的人工浸染能力分別為第6周平均成活率3.7%和5.56%；此外，風(fēng)輪菜白粉病菌由于菌樣收集質(zhì)量欠佳，DNA提取及PCR擴增效果不佳，未參與分子標記聚類，但其對煙草的人工浸染能力較強，浸染第6周平均成活率達到35.19%。因此，在煙草實際生產(chǎn)中煙田及附近的羊蹄、葵花和風(fēng)輪菜也要注意防范。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

RAPD Analysis of Nonnicotiana Plants anDTobacco Powdery Mildew Fungus in Open Tobacco Field in Guizhou Province

HUANG Tuan1，2，F(xiàn)AN Chengping3，LU Zhiwei4，ZUO Rui2
（1.College of Agriculture and Food Engineering，Baise University，Baise，Guangxi 533000；2.Biotechnology Institute of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou550006；3.Anshun Branch of Guizhou Tobacco Company，Anshun，Guizhou561000；4.China Tobacco Guizhou Industrial CO.，LTD.，Guiyang，Guizhou550006，China）

13samples of powdery mildew fungus were collected and separated from diseased nonnicotiana plants anDTobacco in open tobacco fielDTo test the potential infection of powdery mildew fungus from different nonnicaotiana hosts to tobacco，anDTo analyze their genetic relationship.And Samples were evaluated by using random amplified polymorphic DNA，anDThe infectivity was identifieDThrough artificial inoculation.Results：High genetic diversity existed among the tested powdery mildew fungus in Guizhou，anDThe similarity coefficient of the 11tested isolates varied from 0.0308to 0.7209.The UPGMA dendrogram divideDThe 11tested isolates，anDThe isolates from Mirabilils jalapaL.，F(xiàn)atouavillosa Nakai anDTobacco were groupeDTogether.Tobacco host are susceptible to the isolates from M.jalapaL.，F(xiàn).Nakai.It shows that there is some potentially association between DNA polymorphism and susceptible to isolates.

nonnicotiana plants；tobacco；powdery mildew fungus；molecular marker

S435.72

A

1001－3601（2016）10－0423－0054－04

2016－07－30；2016－10－10修回

廣西高等學(xué)校優(yōu)勢特色專業(yè)群建設(shè)項目“亞熱帶農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)專業(yè)群”［桂教高教（201541）66］；貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技專項“煙草白粉病綜合防治技術(shù)研究”（黔煙工科201224）

黃 團（1981－），男，副研究員，碩士，從事植物遺傳育種及生物技術(shù)等研究。E－mail：hwanjiang＠hotmail.com