小分子非編碼RNA與雄性不育

廖珂 柴志欣 鐘金城

（西南民族大學(xué) 動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

小分子非編碼RNA與雄性不育

廖珂 柴志欣 鐘金城

（西南民族大學(xué) 動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

小分子非編碼RNA（Small non-coding RNA，sncRNA）是一類20-30個左右核苷酸長度的RNAs，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但在調(diào)控機制方面具有廣泛的生物學(xué)功能。在動物精子形成過程中有兩類sncRNAs，即miRNAs和piRNAs起著重要調(diào)控作用，它們在動物睪丸組織中表達(dá)異常會導(dǎo)致精子生成障礙從而表現(xiàn)出雄性不育性狀。綜合分析了sncRNA的結(jié)構(gòu)、功能以及對雄性動物生育能力的影響，以期為進一步研究sncRNA的調(diào)控機制提供參考。

小分子非編碼RNA；精子形成；雄性不育

以往很多研究更為重視的是基因組中的編碼序列，而約98%的非編碼序列是隨著對基因組及其功能的研究深入才逐漸引起人們的重視。小分子非編碼RNA（Small non-coding RNAs，sncRNAs）是一類核苷酸長度在20-30 nt左右的非編碼RNA（Noncoding RNA，ncRNA）［1］，過去被認(rèn)為是剪切加工的剩余產(chǎn)物，近年來的研究發(fā)現(xiàn)這一類小分子的生物學(xué)功能具有高度的組織特異性或發(fā)育階段特異性，逐漸成為研究的熱點。目前主要將ncRNAs分為3類，即piRNA（Piwi-interactingRNA，與piwi蛋白相互作用的RNA）、microRNA（miRNA，微小RNA）和si-RNA（小干擾RNA）［1］。研究發(fā)現(xiàn)sncRNA參與生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平上的調(diào)控，其中miRNA和piRNA通路是雄性不育動物模型研究中最重要的兩條路徑［2-4］。一般情況下，miRNA調(diào)節(jié)精子形成是通過靶向結(jié)合在轉(zhuǎn)錄本的3' UTR區(qū)和下調(diào)細(xì)胞中特定的轉(zhuǎn)錄本來促進精子的發(fā)育，而piRNA則在生精過程中強烈抑制轉(zhuǎn)座子元件的表達(dá)。本文綜合分析了精子形成過程中相關(guān)sncRNAs的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控機制以及對動物雄性不育的影響，以期為進一步研究sncRNA的調(diào)控機制提供參考。

1 sncRNA概述

真核生物細(xì)胞內(nèi)的RNA一般分為編碼RNA和非編碼RNA。目前發(fā)現(xiàn)，人類基因組中有2%的序列參與編碼蛋白質(zhì)，即翻譯過程中產(chǎn)生的mRNA屬于典型的可編碼RNA，其余為非編碼序列［5］。sncRNAs是一類非編碼RNAs，即屬于不會編碼蛋白質(zhì)RNAs（ncRNA）的一部分。而ncRNA早在50年前就已被發(fā)現(xiàn)，1965年R. W. 霍利［6］在面包酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的丙氨酸t(yī)RNA和之后發(fā)現(xiàn)的rRNA都是非編碼RNA；其中rRNA含量占總RNA的約82%，隨著研究的發(fā)展，現(xiàn)在越來越多的新型ncRNA得以被發(fā)現(xiàn)，如核小RNA（snRNAs）、小RNA（miRNA）、與Piwi蛋白結(jié)合RNA（piRNA）、長鏈非編碼（lnc-RNA）等。

ncRNA主要從轉(zhuǎn)錄來源、分子長度、功能等進行分類。從ncRNA轉(zhuǎn)錄來源分類，主要有內(nèi)含子型和基因間型，前者由基因中的內(nèi)含子序列轉(zhuǎn)錄而來，后者主要源于兩基因間DNA序列的轉(zhuǎn)錄［7］。ncRNA核苷酸片段同時也具有高度的大小特異性，其中分子長度多于200個核苷酸的通常被稱作長鏈ncRNA，少于200個核苷酸的稱為短鏈ncRNA［8］。sncRNAs屬于短鏈ncRNA，長度在20-30 nt左右。它主要包括小干擾RNA（siRNA）長度在21-23 nt，微小RNA（miRNA）長度在19-25 nt，生殖細(xì)胞含量豐富的與piwi（p-element induced wimpy testis）作用的RNA（piRNA）大部分在24-34 nt［1］。

sncRNAs通常與高度守的Argonaute蛋白家族結(jié)合，該蛋白家族根據(jù)結(jié)構(gòu)特異性可要分為兩個亞家族：AGO和PIWI；兩類亞家族分別具有兩個特殊的結(jié)構(gòu)域，即PAZ（Piwi-Argnonaute-zwille）域和PIWI（p-element induced wimpy testis）域［3］。在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中，miRNA、siRNA一般與AGO蛋白家族結(jié)合；而piRNA與piwi蛋白結(jié)合并且高度富集在生殖細(xì)胞中。miRNA在哺乳動物細(xì)胞中的基本功能是負(fù)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，但是通過Dicer敲除實驗發(fā)現(xiàn)后代生殖細(xì)胞中miRNA的含量大幅減少［3］；還有相關(guān)實驗通過對豬性成熟前后睪丸組織差異表達(dá)miRNA鑒定及功能分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs在動物睪丸發(fā)育成熟、生殖細(xì)胞的功能分化以及精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用［9］。Watanabe等［10］研究發(fā)現(xiàn)病變的睪丸組織中發(fā)現(xiàn)piwi-RNA分子的初級加工產(chǎn)物受到影響而次級加工產(chǎn)物未受影響，同時發(fā)現(xiàn)piwi蛋白家族（MILI、MIWI2 和MIWI 3個成員）是成功形成精子所必需的一類蛋白家族，在精子形成過程中起到關(guān)鍵作用。miRNA和piRNA都在調(diào)節(jié)雄性生殖細(xì)胞分化過程中起到重要作用。

2 sncRNA的結(jié)構(gòu)與功能

2.1 miRNA的結(jié)構(gòu)與功能

miRNA是一種約19-25 nt長度的高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在動物睪丸的發(fā)育成熟、生殖細(xì)胞的功能分化以及精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用［11］。miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，主要由基因間隔區(qū)、內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)錄而來［9］。這一類sncRNA的表達(dá)具有組織特異性，但在不同生物體又表現(xiàn)出較高的同源性。

大量實驗證據(jù)表明，miRNA可能是不同類型的組織細(xì)胞調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，尤其是在睪丸組織中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對精子的發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。大多數(shù)哺乳動物的mRNA都是miRNA的保守靶位，主要是通過與轉(zhuǎn)錄修飾后mRNA的3' UTR區(qū)結(jié)合來在抑制mRNA翻譯，與mRNA的作用結(jié)合部分高達(dá)2-7個核苷酸；這類sncRNAs與編碼蛋白的基因間有著較大的關(guān)聯(lián)性，因為許多基因編碼蛋白都會受到miRNA路徑的調(diào)控［12］。在miRNA的調(diào)控機制中其表達(dá)與相關(guān)因子呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，Bj?rk等［13］發(fā)現(xiàn)在睪丸組織中高富含miR-18，精子形成過程中它的表達(dá)與熱休克因子2（HSF2）的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，曲精小管中抑制miR-18的表達(dá)會導(dǎo)致HSF2蛋白水平增加、調(diào)控HSF2靶基因的表達(dá)。在精子形成過程中，許多組織如何利用miRNAs來控制基因的表達(dá)，miRNA通路中miRNAs的調(diào)控作用和靶位結(jié)合，目前這一系列的具體機制尚未明確；只是在圓形精細(xì)胞的擬染色體上發(fā)現(xiàn)了miRNA和miRNA相關(guān)蛋白，miRNA路徑中其他組件蛋白在擬染色體外。

miRNA的編碼序列在基因組中全部能夠找到，但將近50%位于內(nèi)含子區(qū)［14］。miRNA的生成主要是由這部分序列編碼的，形成初始miRNA（primiRNA）后經(jīng)加工成為前體miRNA（pre-miRNA），最后剪切成為成熟的miRNA。pri-miRNA由miRNA相應(yīng)的基因序列在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄形成的產(chǎn)物，此時在核內(nèi)的pri-miRNA具有一個長的發(fā)卡莖環(huán)結(jié)構(gòu)，發(fā)卡尾部還有兩條單鏈；然后被雙鏈RNA核酸內(nèi)切酶Drosha切割形成pre-miRNA被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)［5，10，16，17］，pre-miRNA此時的結(jié)構(gòu)與pri-miRNA相比是丟失了發(fā)卡尾部的單鏈。細(xì)胞質(zhì)中pre-miRNA的莖環(huán)區(qū)在內(nèi)切核酸酶Dicer的作用下切除，形成成熟的miRNA，此時miRNA仍然具有前體的發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，只是失去了莖環(huán)。隨后進入一個具有AGO蛋白的核糖蛋白復(fù)合體，這個復(fù)合體是miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRISC），在mRNA翻譯中起到靶位錨定作用［16］。mRNA被鎖定與否主要根據(jù)AGO蛋白的類型和mRNA與miRNA的互補程度［16，17］。例如，哺乳動物AGO蛋白家族中的AGO2是唯一能裂解RNA的成員，它能在mRNA-miRNA高度互補配對的情況下與mRNA結(jié)合并使其降解［16-18］。然而，與miRNA互補性較低或者完全不互補配對的mRNA被認(rèn)為是封存在細(xì)胞質(zhì)顆粒內(nèi)或是翻譯抑制。通過miRNA引起的翻譯抑制機制已經(jīng)被提出，miRNA能立即對mRNA的poly-A尾巴進行脫腺苷化，避免poly-A綁定蛋白結(jié)合而發(fā)生有效翻譯［19］。此外，AGO2綁定在修飾過的mRNA的5'端，與真核起始因子4E（eIF4E）競爭結(jié)合位點，從而阻止翻譯起始［20］，同時eIF6阻止功能型核糖體80s亞基的形成［21］。另一方面，miRNA也能促進翻譯的發(fā)生，但是僅限于細(xì)胞處于增殖狀態(tài)或mRNA靶位的3' UTR富含腺嘌呤和鳥嘌呤核糖核苷酸。

在小鼠發(fā)育早期階段，讓小鼠條件性的失去Drosha或Dicer酶類，精子形成會被阻斷，由此睪丸中miRNA功能機制的研究對精子發(fā)育十分重要。通過部分純化的生殖細(xì)胞或是整個睪丸組織的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，小鼠或人類的睪丸中都有其特有的miRNA類群［22-31］，其中已發(fā)現(xiàn)部分參與哺乳動物精子的形成。

2.2 piRNA結(jié)構(gòu)與功能

正如前面所提到的，sncRNA的生物學(xué)功能對精子的形成過程至關(guān)重要。piRNA是另一類內(nèi)源性sncRNA，其核苷酸長度為24-30個左右，它的產(chǎn)生不依賴Dicer酶，而是與piwi蛋白作用［30］。隨著物種不斷的進化，piRNA基因序列具有較低的保守性，但這類分子仍有活性，在果蠅中，piRNAs主要存在于胚胎、雌性和雄性生殖系中，編碼piRNAs的基因主要位于基因組重復(fù)區(qū)域的轉(zhuǎn)座元件中，piwi通路在精子形成過程中有沉默逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特定作用［31，32］。在哺乳動物中，區(qū)別于果蠅，piRNAs主要富集在雄性生殖系，且編碼piRNAs基因序列主要存在于不含有轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列的未注釋的基因間區(qū)域內(nèi)［33］。然而，目前對于起源于轉(zhuǎn)座元件外的piRNAs的功能仍然未知。有實驗表明，轉(zhuǎn)座子的控制與精子的發(fā)生有關(guān)，有利于保護遺傳信息的穩(wěn)定傳遞［34-36］。缺乏piwi通路元件的動物模型表現(xiàn)為雄性不育，例如，敲除MIWI，MILI或MIWI2基因，都會造成小鼠精子產(chǎn)生明顯缺陷，表現(xiàn)為雄性不育這也揭示了piRNA與精子形成的相關(guān)性［30，37］。

piRNA具有廣泛的多樣性，大約有上百萬種類別，與僅有幾百種的miRNA相比數(shù)目就顯得龐大許多，這種多樣性可能主要來源于對前體piRNA的剪切加工。在精子形成過程中，piRNA的序列大小與特異性變化很大，哺乳動物中主要將其分為兩類：粗線前期piRNA與粗線期piRNA［5，37］。piRNA序列包含重復(fù)序列、來自基因間和基因區(qū)域的序列，由此大多數(shù)piRNAs定位于基因組的簇集位點，存在于遺傳序列之間、遺傳序列內(nèi)部以及外部。粗線前期piRNA富含重復(fù)序列，主要與MIWI2和MILI兩種蛋白結(jié)合；而粗線期piRNA大多是基因間DNA編碼的序列，主要與MILI和MIWI蛋白結(jié)合，這一類分子通常出現(xiàn)在精母細(xì)胞的粗線期和圓形精細(xì)胞中［34，38-41］。在剛出生幾天小鼠的睪丸組織中主要發(fā)現(xiàn)的是粗線前期piRNA，在產(chǎn)后14.5 d小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，精細(xì)胞發(fā)育進入到第一次減數(shù)分裂的粗線期時，粗線期piRNA出現(xiàn)［42］。有趣的是這些粗線期piRNA在成年小鼠piRNA總量中所占比例高于95%，轉(zhuǎn)錄因子A-MYB通過直接調(diào)控piRNA轉(zhuǎn)錄本和參與piRNA通路的蛋白組件的編碼基因來促進起始粗線期piRNA的產(chǎn)生［42］。

piRNA通路十分復(fù)雜，且目前尚未有明確定論。piRNA通路不同于miRNA路徑，它不依賴Dicer酶活動。目前大多認(rèn)為有兩種通路，對初始piRNA進行初級加工，再通過“乒乓”擴增效應(yīng)機制擴增piRNA且piwi蛋白具有酶切活性，由此來促進piRNA前體形成piRNA。在小鼠前精原細(xì)胞的粗線前期，piRNA是僅通過前體初級加工而成的產(chǎn)物，后續(xù)在初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞中“乒乓”效應(yīng)機制是主要的生物途徑［43］。在初始加工中，piRNA前體是一條長的單鏈RNA，由piRNA基因簇轉(zhuǎn)錄而來，包括正義鏈和反義鏈；正義piRNA前體優(yōu)先與MILI綁定活化轉(zhuǎn)座子元件，反義前體piRNAs次級加工產(chǎn)物大多與MIWI2作用，能在轉(zhuǎn)錄水平通過DNA甲基化沉默轉(zhuǎn)座子；其5'端與piwi蛋白家族成員相連，3' UTR被剪切產(chǎn)生特異的piRNA［32，38，43，44］。關(guān)于“乒乓”擴增機制，piwi蛋白（小鼠中的MILI）能識別初始piRNA前體，在其距離5'端10th的位置結(jié)合產(chǎn)生切割活性，形成次級piRNA前體［32，44］；在這個位置上次級piRNA前體被另一個piwi蛋白MIWI2識別結(jié)合并擴增，擴增出來的則是初始piRNA前體又再一次被MILI識別進入下一個擴增循環(huán)。MILI偏向于與初始piRNA前體結(jié)合，MIWI2則更易與次級piRNA前體結(jié)合，在“乒乓”機制中各司其職［40］。通過“乒乓”循環(huán)同時產(chǎn)生的piRNA，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄本由piRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體降解［44，45］，這個機制只有在初生小鼠的睪丸組織中能觀察到，而成年小鼠中卻沒有，成年小鼠中MIWI2不表達(dá)，說明MILI和MIWI涉及piRNA的初始加工［46］。

3 sncRNA對雄性動物生育能力的影響

物種的起源和自我維護會依靠一種生殖隔離機制，即排斥與其他物種進行基因交流。其中一種生殖隔離機制的表現(xiàn)形式是雄性不育，許多自然雜交的后代可以存活，但是其雄性個體往往表現(xiàn)為完全不育或者部分不育。雜種雄性不育個體通常在兩個水平上發(fā)育受到影響：一是性腺發(fā)育；二是精子形成。性腺發(fā)育受阻，不能發(fā)育成完整的睪丸因此表現(xiàn)為雄性不育，或是產(chǎn)生較小的睪丸進而有可能導(dǎo)致產(chǎn)生精子數(shù)量偏少。精子形成水平上一般存在兩方面問題，一是生精過程受阻導(dǎo)致產(chǎn)生的精子數(shù)量不足或不產(chǎn)生精子；二是產(chǎn)生異常精子。sncRNA會調(diào)控精子的形成對雄性動物的生育能力產(chǎn)生影響。這方面的研究開始于睪丸組織切片、精子形態(tài)數(shù)量的觀察研究，并逐步從組織形態(tài)觀察過度到分子層面的研究，大量研究表明挖掘雄性不育的機理更有助于了解或解決雄性不育的問題。目前對精子形成過程中的sncRNA研究已初見成就，下面主要描述3種miRNA，即miR-122、miRNA-383、mir146，在雄性不育精子形成過程中的研究進展。

精子異常是雄性不育的主要因素，其發(fā)病機理仍不明確。MicroRNA在不育男性患者異常精子中的作用還未被研究清楚。Liu等［46］用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞探究miR-122在體外表達(dá)對精細(xì)胞分化的影響；在誘導(dǎo)以后，用miR-122突變體轉(zhuǎn)染已形成細(xì)胞的精子，再用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞形精子的單倍體細(xì)胞群中DNA含量，miR-122突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA含量明顯比正常miR-122轉(zhuǎn)染細(xì)胞的有所增加。誘導(dǎo)過程中，突變體miR-122轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)換蛋白2（TNP2）含量和魚精蛋白的mRNA、蛋白水平含量都比正常miR-122轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的要高［47］。對兩組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行蛋白質(zhì)分析，脂蛋白含量存在顯著差異。研究表明miR-122與精子變形有關(guān)，miR-122可能通過抑制TNP2的表達(dá)來影響細(xì)胞形成精子，并抑制精子發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)。

最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA-383的異常表達(dá)也與雄性不育有關(guān)。miRNA-383的表達(dá)在精子成熟性障礙不育男性的睪丸組織中相對下調(diào)，但其在精子形成過程中的作用機制和功能還不清楚。Tian等［47］的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠睪丸組織中有88種miRNAs與X脆性智力低下蛋白（FMRP）有關(guān)，其中也包括miRNA-383。敲除Fmr1基因（X脆性智力低下蛋白基因）以后，睪丸畸胎瘤細(xì)胞（NT-2）中FMRP變低，miRNA-383對細(xì)胞增殖的抑制作用增強，F(xiàn)MRP與miRNA-383作用大幅度減少，影響miRNA-383與靶基因3'-UTR區(qū)的結(jié)合，比如，干擾素調(diào)節(jié)因子1（IRF1）和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA的3'-UTR區(qū)。另一方面，精原細(xì)胞和NT-2中miRNA-383的過度表達(dá)能下調(diào)FMRP的水平含量。miRNA-383直接與細(xì)胞周期蛋白D1結(jié)合，抑制其基因的下游效應(yīng)元件，減少FMRP的表達(dá)。在FMRP下調(diào)表達(dá)的病人和敲除Fmr1基因的小鼠睪丸中都有發(fā)現(xiàn)，降低miRNA-383的表達(dá)，miRNA-383的下游基因表達(dá)異常。通常認(rèn)為在精子形成過程中FMRP和miRNA-383之間可能存在一種反饋鏈，F(xiàn)MRP對miRNA-383的功能起負(fù)調(diào)控作用。FMRP通過與miRNA-383和它的靶位IRF1/ Cyclin D1結(jié)合來影響miRNA-383與其3'-UTR作用并調(diào)控miRNA-383的功能。

Huszar等［48］發(fā)現(xiàn)mir146生物合成受阻會破壞精子形成從而導(dǎo)致雄性小鼠不育，此外還發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)mir146高度調(diào)節(jié)精原細(xì)胞的分化，這個過程有賴于視黃酸信號。相對于分化的精原細(xì)胞，mir146在未分化的精原細(xì)胞中含量較高，mir146直接作用靶標(biāo)是中間復(fù)合體1，mir146與中間復(fù)合體亞基1（一種類維生素A受體的輔助調(diào)節(jié)因子）的3' UTR區(qū)結(jié)合。mir146的表達(dá)水平會影響精原細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的水平，一般過分表達(dá)會減少精原細(xì)胞過程中的轉(zhuǎn)錄本水平，如在未分化的精原細(xì)胞中mir146過分表達(dá)會減少中間復(fù)合體1轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平，反之，抑制mir146會影響精原細(xì)胞分化的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，這樣培養(yǎng)的細(xì)胞往往不能正常分化為精子，可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。體外暴露在視黃酸下的雄性生殖細(xì)胞會誘導(dǎo)精原細(xì)胞的分化及后來精母細(xì)胞的減數(shù)分裂。研究發(fā)現(xiàn)暴露在視黃酸條件下的精原細(xì)胞mir146會被下調(diào)，精原細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)視黃酸誘導(dǎo)而促進分化，生殖細(xì)胞成分中已分化精細(xì)胞趨于含量更低，由此看來在分化過程中依靠視黃酸信號來調(diào)節(jié)精細(xì)胞的分化過程。

國內(nèi)對動物sncRNA方面的研究亦隨著小分子RNA研究的興起而逐漸被重視，有研究者利用動物模型對sncRNA在精原干細(xì)胞分化過程中的作用或生殖干細(xì)胞中的表達(dá)做了一定的研究。例如，在miR-34家族中的miR-34c，在細(xì)胞內(nèi)的多個過程中都有作用，對精子發(fā)生過程也有重要的調(diào)控作用。Nanos是一類進化保守的RNA結(jié)合蛋白，在生殖細(xì)胞（包括原始生殖細(xì)胞和生殖干細(xì)胞）發(fā)育中發(fā)揮功能。在小鼠中，Nanos2在精原干細(xì)胞中表達(dá)，在精子發(fā)生過程中具有維持干細(xì)胞多能性的作用。于萌等［49］以miR-34c作為研究對象，預(yù)測發(fā)現(xiàn)Nanos2是miR-34c的靶基因之一，構(gòu)建其雙熒光素酶報告基因載體及雙熒光素酶報告基因突變載體驗證靶基因，通過在分離的原代及傳代精原干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染合成的miRNA模擬物、抑制物，及使用含有miR-34c慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的曲細(xì)精管，檢測、分析生殖細(xì)胞分化特異性標(biāo)志基因的變化，深入研究了miR-34c對生殖細(xì)胞分化特異性標(biāo)志基因的調(diào)控作用，研究結(jié)果證實miR-34c可能會通過靶向Nanos2以促進精原干細(xì)胞的分化。徐璐等［50］以原始生殖細(xì)胞和精原干細(xì)胞為細(xì)胞模型，利用Realtime qPCR技術(shù)檢測了Piwil1基因在如皋黃雞生殖系干細(xì)胞中的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，Piwil1基因在生殖系細(xì)胞中特異性表達(dá)，且Piwil1基因在精原干細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于原始生殖細(xì)胞，這表明Piwil1基因可能在精原干細(xì)胞的“DNA重新甲基化”以及自我更新過程中發(fā)揮重要作用。

精子的形成過程是雄性不育研究的重點，但是目前都還處于起步階段，很多機理及作用機制還未研究清楚，也許將來這方面會成為sncRNA的研究熱點，同時也對雄性問題不育研究提供參考，有望解決動物遺傳育種方面的雄性不育問題。

4 在動物遺傳育種中應(yīng)用

雜種雄性不育在物種間是一種普遍的生殖隔離現(xiàn)象，然而很少知道導(dǎo)致這種不育現(xiàn)象的發(fā)生原因，尤其是在自然雜交的物種中。為探究雄性不育的原因，Lisa等［51］以蟾蜍為研究對象，使美國西南部地方的平地蟾蜍和墨西哥蟾蜍雜交得到雜交后代發(fā)現(xiàn)，雜種后代可以存活，但雄性雜交后代生育能力降低。比較雜交后代和正常蟾蜍的睪丸大小和不同發(fā)育階段生殖細(xì)胞的形成狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，雜交雄性后代的睪丸大小與純種的不同，雜交個體中睪丸大小變異范圍比較大。精細(xì)胞形成早期階段數(shù)目與純種相似，但是成熟精子的形成明顯少于純種的。滲入過其他物種基因的個體產(chǎn)生的精細(xì)胞要么異?；我床痪哂蝿有?。這些結(jié)果表明，雜種的不相容性在精子的后期發(fā)育中也是種間繁殖的屏障。類似的試驗在國內(nèi)也曾做過，余勁聰?shù)龋?2］在牦牛和雜交后代犏牛上做過組織形態(tài)學(xué)、精子發(fā)生過程研究。犏牛，即牦牛和普通黃牛的雜種。牦牛主要分布于以青藏高原為中心及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有牛種，對高寒草地的生態(tài)環(huán)境有極強的適應(yīng)性，在空氣稀薄、牧草生長期短、寒冷和枯草期長的惡劣環(huán)境下生活自如，繁衍后代，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠?、肉、毛、役力及燃料等生產(chǎn)、生活必需品，是當(dāng)?shù)夭豢苫蛉钡男竽翗I(yè)經(jīng)濟［53］。但是繁殖能力在2年一胎或3年一胎的水平，無法滿足當(dāng)?shù)啬撩竦男枨?，于是想通過牦牛與普通牛雜交得到較高繁殖力、較高產(chǎn)奶量等經(jīng)濟價值較高的雜種牛即犏牛。雜交代（犏牛）產(chǎn)奶量高，但雄性不育，而母犏牛無論與普通?；亟贿€是與牦牛回交，生產(chǎn)的后代生產(chǎn)性能都低下。若能解決犏牛的雄性不育問題則有助于提高當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟，從而能解決犏牛這種較高經(jīng)濟性狀的繁殖問題以滿足人類所需。

目前關(guān)于miRNA通過對關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控來介導(dǎo)精子生成的遺傳機制的報道較少，有關(guān)動物miRNAs基因功能以及與動物繁殖性狀相關(guān)的miRNAs也鮮有研究。Chen等［54］在對水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系研究中，設(shè)計了一個轉(zhuǎn)基因的方法來改善植物的高度和雄性不育系雜交水稻圓錐花序的延伸和培養(yǎng)雜交半矮稈植物。使用方法包括兩個部分：人工microRNA（amiRNA）和人工靶序列模擬，可以篡改內(nèi)源性Eui1基因（與水稻節(jié)間伸長有關(guān)）的差異表達(dá)。amiRNA是近年來發(fā)展起來具有較高特異性基因沉默的方法，而人工靶序列模擬具有天然抑制miRNA功能機制的特點，是最近發(fā)展起來的一種方法。這種方法提供了一個范例，通過與amiRNA結(jié)合和人工靶序列模擬技術(shù)，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)和實現(xiàn)所需的表型。

5 展望

綜上所述，有望通過對犏牛和普通牛睪丸組織的sncRNAs的深入研究解決犏牛的雄性不育問題，可對精子形成過程中研究比較多的miRNA、piRNA及其靶位進行人工干預(yù)。隨著研究的不斷展開和深入，對于miRNA在精子形成中的作用及其機制的闡明，以及利用多種分析預(yù)測手段研究miRNA與精子形成中各調(diào)控蛋白組成的關(guān)系，將會使人們對高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)理解提高到一個新的水平，對miRNA作用機制的研究可以為解決雄性不育問題奠定理論基礎(chǔ)，也可為未來采用小分子干預(yù)生殖調(diào)節(jié)、治療生殖相關(guān)疾病以及動物育種方面的問題提供新策略。

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（責(zé)任編輯狄艷紅）

Small Non-coding RNA and Male Sterility

LIAO Ke CHAI Zhi-xin ZHONG Jin-cheng
（Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Southwest University for Nationalities，Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

Small non-coding RNA（sncRNA）is a kind of RNA with 20-30 nucleotides， and does not have the function of encoding proteins， but has extensive biological functions in terms of regulatory mechanism. In the process of animal sperm formation there are two types of sncRNAs， namely miRNAs and piRNAs playing a critical regulatory role. When they are expressed abnormally in testicular tissues of animals，which causes the production of sperms in obstacle， so as male sterility would appear. In this paper， we summarize sncRNA’s structure and function， and effects on male fertility in order to offer the

for the further researches of the sncRNA regulatory mechanisms.

small non-coding RNA；spermatogenesis；male sterility

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.007

2015-05-08

國家科技支撐計劃課題（2012BAD13B06），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（11NZYTH03）

廖坷，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)；E-mail：15184442679@163.com

鐘金城，男，博士，教授，研究方向：動物遺傳學(xué)；E-mail：zhongjincheng518@126.com