生物組織中幾種有機(jī)化合物的定量檢測

王子武 孫海榮

(安徽省利辛高級中學(xué) 236700)

在中學(xué)生物學(xué)教材中，介紹了對有機(jī)化合物進(jìn)行的定性檢測。例如，淀粉遇碘呈藍(lán)色；蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應(yīng)生成紫色物質(zhì)等。本文介紹幾種常用的有機(jī)化合物的定量檢測方法。

1 蛋白質(zhì)含量的測定

1.1 凱氏定氮法 蛋白質(zhì)中主要含C、H、O、N等元素，與濃硫酸共熱后，C、H分別氧化成CO2和H2O，N則轉(zhuǎn)變成氨，氨進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。消化液經(jīng)強(qiáng)堿堿化之后，游離出氨，利用水蒸氣將氨蒸餾到酸液中，根據(jù)酸液被中和的程度可計(jì)算出樣品的含氮量。蛋白質(zhì)平均含氮量為16%，即1 g氮相當(dāng)于6.25 g蛋白質(zhì)，用測定的含氮量乘以6.25，即為樣品中的蛋白質(zhì)含量。由于三聚氰胺含氮量較高，不法商人在奶粉中添加三聚氰胺以提高奶粉的含氮量，利用的就是這個(gè)原理。此法易受到其他含氮有機(jī)物的干擾，因而測到的結(jié)果為粗蛋白。

1.2 雙縮脲試劑法 蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，可與雙縮脲試劑中的硫酸銅反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，即雙縮脲反應(yīng)。一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈正相關(guān)，利用分光光度計(jì)測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和待測樣品的吸光度，即可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。此法可用于測定1～10 mg/mL含量的蛋白質(zhì)。

1.3 紫外吸收法 由于多數(shù)蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸，使蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280 nm，這一波長下的吸收值與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，利用這一原理可測定蛋白質(zhì)的含量。該方法不消耗蛋白質(zhì)樣品，鹽類干擾不明顯，應(yīng)用廣泛，可用于測定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白質(zhì)。

1.4 考馬斯亮藍(lán)染色法 考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，前者的可見光吸收峰值為465 nm，后者的吸收峰值為595 nm。在595 nm波長下，結(jié)合物的光吸收量與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)[1]。此法靈敏度高，但樣品不能回收，可用于測定0.01～1.0 mg/mL含量的蛋白質(zhì)。

2 糖類含量的測定

2.1 淀粉含量的測定——DNS法 淀粉在稀硫酸作用下水解為葡萄糖、麥芽糖等還原性糖，還原性糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-一硝基水楊酸。一定范圍內(nèi)，還原糖的含量與棕紅色物質(zhì)的顏色深淺呈正相關(guān)，利用分光光度計(jì)，在540 nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。

2.2 葡萄糖含量的測定——碘量法 I2與NaOH作用可生成次碘酸鈉(NaIO)，次碘酸鈉可將葡萄糖分子中的醛基定量地氧化為羧基。未與葡萄糖作用的次碘酸鈉在堿性溶液中歧化成NaI和NaIO3。當(dāng)酸化時(shí)，NaIO3又恢復(fù)成I2析出，用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定I2，從而可計(jì)算出葡萄糖含量。

2.3 纖維素含量的測定——比色法 纖維素含量測定的方法很多，例如，酸堿醇醚法、酸性洗滌劑法、碘量法及比色法等。其中酸堿醇醚法是國際法，但過程比較繁瑣，以下介紹比色法。纖維素是由葡萄糖基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其分解成葡萄糖。然后在濃硫酸作用下，使單糖脫水生成糠醛類化合物，利用蒽酮試劑與糠醛類化合物的藍(lán)綠色反應(yīng)即可進(jìn)行比較測定。

3 脂質(zhì)含量的測定

3.1 脂肪含量的測定——索氏提取法 脂肪含量的測定有索氏提取法、酸水解法、巴布科克法、益勒式法等，其中具有代表性的是索氏提取法。脂肪不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，可用無水乙醚將游離的脂肪萃取出來，然后回收，除去溶劑并干燥，殘?jiān)礊橹尽４朔ㄊ占闹局泻?、蠟狀物等雜質(zhì)，故索氏提取法測得的脂肪為粗脂肪。

3.2 膽固醇含量的測定——化學(xué)試劑比色法 膽固醇含量測定的方法有化學(xué)試劑比色法、酶分析法、熒光法、氣相和高效液相色譜法等五類，臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的是化學(xué)試劑比色法。膽固醇及其酯在硫酸作用下與鄰苯二甲醛作用，生成紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)在533 nm對光有最大吸收，可用分光光度計(jì)測定，通過比較標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液與待測樣品的吸光度，可確定膽固醇的含量。

3.3 磷脂含量的測定——鉬藍(lán)比色法 磷脂經(jīng)灼燒成為五氧化二磷，后者可被熱鹽酸變成磷酸，遇鉬酸鈉生成磷鉬酸鈉，用硫酸聯(lián)氨還原成鉬藍(lán)，用分光光度計(jì)在波長650 nm處測定鉬藍(lán)吸收度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可計(jì)算磷脂含量。

4 核酸含量的測定

4.1 紫外吸收法 DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，最大吸收值在250～270 nm之間，吸收峰在260 nm。在波長260 nm紫外光下,1個(gè)OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 μg/mL，單鏈DNA或RNA為20 μg/mL，可計(jì)算核酸樣品的濃度。

4.2 熒光法 核酸本身在常溫下有較弱的內(nèi)源熒光，但熒光量子產(chǎn)率低，不能直接加以測量，可用一些熒光小分子物質(zhì)作為生物探針，與核酸作用后導(dǎo)致熒光度的增強(qiáng)或減弱來進(jìn)行測定。常用的探針物質(zhì)主要有熒光染料、金屬離子、金屬配合物及納米粒子等[2]。

5 其他有機(jī)化合物含量的測定

5.1 ATP含量的測定——高效液相色譜法 國內(nèi)外ATP含量的測定方法可歸納為層析法、電泳法和光學(xué)分析法三大類，層析法中的高效液相色譜法最為常用[3]。該方法的原理為：利用二次蒸餾水配制一定濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后利用高效液相色譜測試儀，對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品在相同的色譜條件下分別單獨(dú)測定，把得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積與被測樣品的色譜峰面積進(jìn)行比較，求得被測組分的濃度。

5.2 色素含量的測定——分光光度法 綠葉中的色素不溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑。同時(shí)，色素在植物細(xì)胞內(nèi)是以色素蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)存在。通常用80%丙酮或95%的乙醇提取色素。應(yīng)用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定吸光度，代入80%丙酮或95%乙醇的色素計(jì)算公式，可計(jì)算出溶液中色素的含量。