六味地黃丸抗焦慮作用的實(shí)驗(yàn)研究*

陳 嶸，李 菊，譚麗萍，殷 華，朱曉松，汝 晶，楊杏芝，朱夢(mèng)茹，季 恩

(1.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500;2.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，昆明 650500)

六味地黃丸抗焦慮作用的實(shí)驗(yàn)研究*

陳 嶸1，李 菊2，譚麗萍2，殷 華2，朱曉松1，汝 晶1，楊杏芝2，朱夢(mèng)茹2，季 恩1

(1.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500;2.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，昆明 650500)

目的:觀(guān)察六味地黃丸的抗焦慮作用。方法:采用改良天敵應(yīng)激復(fù)制小鼠焦慮模型，與地西泮陽(yáng)性對(duì)照組比較，觀(guān)察高、中、低3個(gè)濃度的六味地黃丸對(duì)焦慮小鼠體質(zhì)量、體溫、飲水量、行為、血清γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA)水平的影響。結(jié)果:與空白組比較，模型組體質(zhì)量減輕、體溫升高，平均飲水量大，OE%、OT%、血清GABA濃度低;與模型組比較，其余各組體質(zhì)量增加，陽(yáng)性對(duì)照組體溫降低，六味地黃丸高、中劑量組平均飲水量小且與陽(yáng)性對(duì)照組的OE%、OT%、血清GABA濃度均較高;與六味低劑量組比較，高劑量組體溫降低，平均飲水量小，OE%、OT%、血清GABA濃度高。結(jié)論:六味地黃丸滋腎陰而抗焦慮，具有量效依賴(lài)性，提高GABA水平是可能機(jī)制之一。

六味地黃丸;焦慮;γ-氨基丁酸;小鼠;實(shí)驗(yàn)

焦慮癥(anxiety disorders)又稱(chēng)為焦慮性神經(jīng)癥，是以廣泛和持續(xù)性焦慮或反復(fù)發(fā)作的驚恐不安為主要特征，常伴有自主神經(jīng)紊亂及運(yùn)動(dòng)性不安的一種神經(jīng)癥，包括廣泛型焦慮(GAD)和驚恐障礙(PD)［1］。其發(fā)病率逐年增高，目前全球范圍達(dá)16.6%［2］，且45%的患者在發(fā)病2年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)未得到及時(shí)有效的治療［3］。臨床應(yīng)用六味地黃丸可緩解焦慮情緒［4-5］，故探討其對(duì)焦慮小鼠的影響及其作用機(jī)制，可為臨床辨證用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

78只SPF級(jí)雄性昆明種小鼠由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供(許可證號(hào)SCXK(川)2013-24)，體質(zhì)量(30.20±1.38)g。

1.2 藥物

六味地黃丸由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供。藥物組成:熟地黃24 g，山萸肉12 g，干山藥12 g，澤瀉9 g，牡丹皮9 g，茯苓9 g。中藥浸泡30 min后常規(guī)水煎3次后過(guò)濾，經(jīng)冷凝回流濃縮成稠浸膏，置4℃冰箱保存，臨用前用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度。地西泮片2.5 mg/片，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科(上海信宜藥廠(chǎng)有限公司，批號(hào)14141001B)。

1.3 主要儀器及試劑

TL-18M高速冷凍離心機(jī)(上海耐圣卡蘭實(shí)業(yè)有限公司)、infiniteM200PRO酶標(biāo)儀(Tecan公司)、BL-2200H電子天平(日本島津公司)等。按文獻(xiàn)［6］自制高架十字迷宮(the elevated plus-maze，EPM):兩個(gè)相對(duì)的開(kāi)放臂(open arm，內(nèi)徑:長(zhǎng)×寬×高): 30 cm×5 cm×15 cm;兩個(gè)相對(duì)的封閉臂(enclosed arm，內(nèi)徑:長(zhǎng)×寬×高):30 cm×5 cm×0.5 cm;連接4只臂的中央平臺(tái)(centre platform，內(nèi)徑，長(zhǎng) ×寬):5 cm×5 cm。其中2個(gè)相對(duì)閉臂上部是敞開(kāi)的，4個(gè)臂及中央平臺(tái)均為黑色，整體同定于鐵質(zhì)支架上，使迷宮底板到距實(shí)驗(yàn)室地面50 cm處。試劑盒:小鼠γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic，acid，GABA) ELISA試劑盒(批號(hào)1052382，上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

78只小鼠常規(guī)飼養(yǎng)6 d適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和六味地黃丸高、中、低劑量組。各組體質(zhì)量、肛溫實(shí)驗(yàn)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

2.2 模型復(fù)制與給藥

依據(jù)中醫(yī)學(xué)“恐傷腎”理論，參照文獻(xiàn)復(fù)制天敵應(yīng)激焦慮小鼠模型［7］:每天9∶00～11∶00AM，將除空白對(duì)照組外的各組小鼠單只放入13 cm×25 cm×25 cm鐵絲籠，再置于50 cm×25 cm×30 cm貓籠內(nèi)，將貓引入籠內(nèi)自由活動(dòng)60 min，但小鼠籠的鐵絲網(wǎng)可阻止貓的攻擊，小鼠可通過(guò)視覺(jué)、嗅覺(jué)及聽(tīng)覺(jué)體驗(yàn)到貓的存在，每天僅在應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，貓進(jìn)食1次，以保證第2天實(shí)驗(yàn)中的貓?zhí)幱陴囸I狀態(tài)，維持其對(duì)小鼠固有的攻擊性;45 min/次/d，持續(xù)7 d并錄制貓的叫聲和排泄物。從第7天開(kāi)始改為貓叫聲聽(tīng)覺(jué)刺激并排泄物嗅覺(jué)刺激，45 min/次/d，再持續(xù)7 d。

造模的同時(shí)，空白組、模型組給予蒸餾水20 ml· kg－1·d－1灌胃，六味地黃丸按高(1.35 g·kg－1· d－1)、中(0.45 g·kg－1·d－1)、低(0.15 g·kg－1·d－1)劑量，陽(yáng)性對(duì)照組給予地西泮0.0003 g·kg－1·d－1配制成同等體積溶液灌胃，每日1次，于每天刺激結(jié)束后進(jìn)行，持續(xù)14 d。

2.3 行為學(xué)測(cè)試與一般情況評(píng)定

高架十字迷宮正上方用支架固定數(shù)碼攝像機(jī)，保證能夠錄制小鼠活動(dòng)全視野。末次給藥后次日(第15天)8∶00～11∶00AM安靜環(huán)境中進(jìn)行，每只小鼠先開(kāi)場(chǎng)適應(yīng)5 min;每次小鼠放入中央格前75%乙醇擦拭，消除前1只的氣味和排泄物;放入時(shí)頭朝封閉臂，觀(guān)察者距離迷宮中央1 m以外，保持測(cè)試客觀(guān)性。每只錄制5 min，待全部結(jié)束后由2名實(shí)驗(yàn)人員觀(guān)察錄像，共同評(píng)定進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)(open arm entry，OE)、進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間(open arm time，OT)、進(jìn)入封閉臂次數(shù)(close armentry，CE)、進(jìn)入封閉臂時(shí)間(close arm time，CT)。計(jì)算入開(kāi)臂次數(shù)百分比(OE%)=OE/(OE+CE)，入開(kāi)臂停時(shí)間百分比(OT%)=OT/(OT+CT)，比值大則較少出現(xiàn)焦慮行為。體質(zhì)量變化=實(shí)驗(yàn)后－實(shí)驗(yàn)前;飲水量以造模期平均量計(jì)算;體溫(肛溫)=實(shí)驗(yàn)后 －實(shí)驗(yàn)前。

2.4 標(biāo)本采集與處理

EPM行為測(cè)試后各組小鼠摘眼球取血，于室溫凝固2 h，1200rcf冷凍離心后迅速分離血清，按GABA試劑盒說(shuō)明操作，上酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，根據(jù)其直線(xiàn)回歸方程Y=0.1312X+0.2916(R2=0.9909)計(jì)算濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

表1顯示，與空白組比較，模型組體質(zhì)量減輕，體溫升高，平均飲水量大，OE%、OT%、血清GABA濃度低;與模型組比較，其余各組體質(zhì)量增加，陽(yáng)性對(duì)照組體溫降低，六味地黃丸高、中劑量組平均飲水量小且與陽(yáng)性對(duì)照組OE%、OT%、血清GABA濃度均較高;與六味地黃丸低劑量組比較，高劑量組體溫降低，平均飲水量小，OE%、OT%、血清GABA濃度高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組小鼠一般情況、焦慮行為與血清GABA濃度的比較(±s)

表1 各組小鼠一般情況、焦慮行為與血清GABA濃度的比較(±s)

注:與空白組比較:*P＜0.05;與模型組比較:#P＜0.05;與六味地黃丸低劑量組比較:ΔP＜0.05

組別濃度例數(shù) 體質(zhì)量變化(g) 體溫變化(℃) 飲水量(ml) OE% OT%一般情況 焦慮行為 GABA例數(shù)空 白 組 11 3.86±1.17 0.13±0.22 5.52±0.26 40.99± 3.8214.98±5.50 10 42.66±1.91模 型 組 10 －2.23±1.13* 0.48±0.15* 7.03±0.37*Δ 20.39± 4.83* 7.09±2.15* 9 29.89±2.07*陽(yáng)性對(duì)照組 10 －1.10±1.65* －0.12±0.19# 5.53±0.26# 40.89± 5.39# 11.22±2.33Δ 9 40.03±2.74*#Δ六味高劑量組 10 0.84±1.29* 0.16±0.23# 5.66±0.32#Δ 41.92± 4.24#Δ 12.53±3.17#Δ 10 39.69±3.94#Δ六味中劑量組 11 0.37±1.69* 0.19±0.26# 5.80±0.31#Δ 36.14±11.13# 12.10±2.22# 9 36.89±1.81*#Δ六味低劑量組 10 1.32±1.73* 0.33±0.29 6.00±0.33Δ 21.33± 7.34# 7.66±2.37# 9 31.16±3.18*

4 討論

研究結(jié)果顯示，模型組小鼠體質(zhì)量減輕，體溫升高，平均飲水量明顯增多，進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)明顯減少，說(shuō)明天敵應(yīng)激成功復(fù)制小鼠焦慮模型。焦慮癥與心理應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)紊亂密切相關(guān)［8］，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA含量降低是其關(guān)鍵的病理機(jī)制。

心理應(yīng)激致焦慮屬于中醫(yī)情志致病范疇，基本病機(jī)體現(xiàn)于腎-肝-心軸［9－10］。但既往研究多集中于心、肝，對(duì)腎的重視不足?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》提出，腎在志為恐，恐則傷腎，且腎陰腎陽(yáng)為全身陰陽(yáng)之根。《類(lèi)經(jīng)圖翼·大寶論》言:“五臟之陽(yáng)非腎陽(yáng)不能生，五臟之陰非腎陰不能滋”;《素問(wèn)·生氣通天論》更提出，陰者，藏精而起亟也;陰不勝其陽(yáng)，則脈流薄疾，并乃狂。故天敵應(yīng)激傷腎陰是情志導(dǎo)致焦慮的主要病機(jī)之一。

作為滋腎陰的經(jīng)典名方，六味地黃丸中的熟地黃、山萸肉、山藥三陰并補(bǔ)而制陽(yáng)，阻抑肝陽(yáng)上亢，故高、中劑量組延長(zhǎng)焦慮小鼠進(jìn)入高架十字迷宮開(kāi)臂的時(shí)間，增加進(jìn)入次數(shù)，利于緊張不安、恐懼、急躁易怒難于自制等精神癥狀的緩解;澤瀉、牡丹皮、茯苓三瀉，瀉濕濁而降相火，防止津液損耗，故高、中劑量組飲水量減少;同時(shí)因補(bǔ)瀉兼施而陰平陽(yáng)秘，調(diào)節(jié)脾胃功能，使小鼠體質(zhì)量增加，符合臨床觀(guān)察的結(jié)論［4、11］。目前認(rèn)為，六味地黃丸調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗衰老、改善學(xué)習(xí)、記憶功能的作用［12］，與降低血漿糖皮質(zhì)激素(GC)水平、誘導(dǎo)海馬神經(jīng)突觸的可塑性密切相關(guān)。據(jù)此推測(cè)，可能同時(shí)具有抗焦慮功能，因焦慮癥下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能亢進(jìn)，血漿糖皮質(zhì)激素(GC)含量增加［8］。但目前尚未見(jiàn)其抗焦慮的實(shí)驗(yàn)報(bào)道，率先基于小鼠血清GABA含量探討其抗焦慮效果，結(jié)果表明高劑量組與低劑量組比較差異顯著，存在量效依賴(lài)性，初步揭示六味地黃丸不僅抗焦慮，且作用機(jī)制可能與提高GABA含量有關(guān)。但與HPA軸的關(guān)系、中樞作用機(jī)制、受體調(diào)控途徑等尚不清楚，需進(jìn)一步研究、闡明。

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Experimental Research on Anti-anxiety Effect of Liuwei Dihuang Pills

CHEN Rong1，LI Ju2，TAN Li-ping2，YIN Hua2，ZHU Xiao-song1，RU Jing1，YANG Xing-zhi2，ZHU Mei-ru2，JI En1

(Yun nan college of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China)

Objective:To observe the anti-anxiety effect of Liuwei Dihuang pills.Methods:The anxiety mice model of predator stress was treated with high，medium，and low concentrations of Liuwei Dihuang pills，compared with diazepam positive control group.And to detect the drug effect，the changes of experimental mice in body weight，temperature，amount of drinking water，behaviors，and the serum γ-GABA level were recorded.Results:The model group was compared with the control group，body weight decreased，body temperature increased，mean amount of drinking water increcsed，serum γ-GABA level，level of OE%and OT%was smaller;Compared with model group，the other groups were with rise of the body weight，body temperature reduced in positive control group，mean amount of drinking water was significantly less in high and medium dose group.For serum γ-GABA level，level of OE%and OT%，we found that control group，high or medium dose group was significantly higher than model group;Compared with low dose group，the body temperature reduced，mean amount of drinking water reduled，the serum γ-GABA level was higher，level of OE%and OT%was higher in high dose group.Conclusion:Nourishing yin recipe Liuwei Dihuang pills had anti-anxiety effect in a concentration effectdependent manner，and one probable mechanism was to up-regulate GABA expression level.

Liuwei Dihuang pills;Anxiety;γ-GABA;Mouse;Experiment

R749.7+2

B

1006-3250(2016)11-1476-03

2016-03-17禮·天官·疾醫(yī)》中的“癢庎”用法同，不可訓(xùn)釋為瘙癢，乃指癰瘡、瘡疥。

云南省教育廳科研基金項(xiàng)目(2014Y243)-滋腎陰方對(duì)焦慮小鼠血清GABA及HPA軸GR表達(dá)調(diào)控作用的研究

陳 嶸(1975-)，男，云南昆明人，副教授，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事情志疾病的防治規(guī)律研究與臨床心理治療。

4.2 馬王堆醫(yī)籍“癢”字例

“癢”字于馬王堆漢墓出土醫(yī)籍一見(jiàn)。即《雜療方》中:“□癢:羊頭□□□□□□□□□暴(曝)干，令凝，以以(蜜)和之，大如□□□□□指端?！?/p>

學(xué)者多將此處“癢”字理解為瘙癢，“疑為女子陰癢之病”［19］，或云此方為“促進(jìn)癢感方”［20］。馬王堆漢墓出土醫(yī)籍中“癢”字皆寫(xiě)作“養(yǎng)”或“ ”，“癢”字僅此處一見(jiàn)，不應(yīng)是瘙癢之義，而是指瘡瘍。此方乃一種治療瘡瘍的涂抹外用方。