用于污染黃曲霉毒素花生分選的熒光信號研究

王葉群，楊增玲，張紹英，劉　婷（中國農業(yè)大學工學院，北京100083）

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用于污染黃曲霉毒素花生分選的熒光信號研究

王葉群，楊增玲，張紹英※，劉婷
（中國農業(yè)大學工學院，北京100083）

摘要：為在加工前將黃曲霉毒素超限的帶衣花生米從原料中剔除，參照已有的色選系統(tǒng)，提出一種依據(jù)黃曲霉毒素含量超限帶衣花生米的專屬熒光信號進行逐粒分選的技術構想。采用Cary Eclipse熒光分光光度計測定100粒外觀具有代表性的帶衣花生米表面的紫外-熒光規(guī)律，通過與免疫親和層析凈化熒光光度法（GB/T18979-2003）檢測結果對比，判定了黃曲霉毒素超限帶衣花生米的熒光光譜特征；通過繪制450/490、460/490熒光強度比值的箱線圖，評估了表面熒光法判斷黃曲霉毒素超限帶衣花生米的準確率；在搭建的熒光成像系統(tǒng)上，對黃曲霉毒素超限帶衣花生米進行了熒光成像。檢測發(fā)現(xiàn)，在365 nm波長激發(fā)下，黃曲霉毒素超限帶衣花生米在420～460 nm處有熒光峰；以450/490熒光強度比值為依據(jù)剔除超限值帶衣花生米的判斷準確率為81%；a.u.＞40的帶衣花生米可在圖像中呈現(xiàn)亮藍熒光光斑。表明表面熒光信號可作為帶衣花生米在線、無損、逐粒分選的專屬光學信號，用于黃曲霉毒素超限帶衣花生米的剔除。

關鍵詞：農產品；熒光；帶衣花生米；黃曲霉素；分選

王葉群，楊增玲，張紹英，劉婷.用于污染黃曲霉毒素花生分選的熒光信號研究[J].農業(yè)工程學報，2016，32（01）：187-192.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.026 http://www.tcsae.org

Wang Yequn, Yang Zengling, Zhang Shaoying, Liu Ting.Fluorescent signal characteristics for sorting of peanut contaminated by aflatoxion[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering（Transactions of the CSAE）, 2016, 32（01）: 187-192.（in Chinese with English abstract）doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.026 http://www.tcsae.org

E-mail：cauzsy@cau.edu.cn

0　引言

花生是重要的食用油原料，占中國油料作物總量的50%左右[1]?；ㄉ谏L、收獲、運輸、貯藏過程中極易感染黃曲霉和寄生曲霉[2-3]，其次級代謝產物——黃曲霉毒素具有強毒性和高致癌、致畸性，毒性是氰化鉀的10倍，被國際癌癥研究機構確定為Ⅰ類致癌物[4-5]。世界各國對花生及其制品中的黃曲霉毒素制定了嚴格的限量標準，中國對花生及其制品中黃曲霉毒素B1的限量為≤20 μg/kg[6-8]。因此，研究污染黃曲霉毒素花生加工前的分選技術，將有效隔絕污染源，以防代治，對確保食品安全意義重大。

帶衣花生米是花生加工利用過程中的主要原料形式。加工前對帶衣花生米進行在線、無損、逐粒分選，可有效防止黃曲霉毒素進入產品。目前，國內外已有花生中黃曲霉毒素的檢測方法，如薄層色譜法、高效液相色譜法、免疫化學方法等，均需破壞花生米的整體性[9-17]；而常規(guī)色選法僅以標定的外觀或表皮特征為依據(jù)進行差異比較分選，常造成外觀合格但毒素超限個體的漏剔[18]；同樣，毒素不超限但外觀異常的個體則多會被誤剔。

此前研究發(fā)現(xiàn)，在紫外光照射下，B族黃曲霉毒素發(fā)藍色熒光，G族黃曲霉毒素發(fā)黃綠色熒光[19-23]。因此，參照已廣泛應用的對顆粒物料進行逐粒色選的技術思路[24-27]，提出了一種帶衣花生米逐粒分選的技術構想[28-29]（見圖1）：將色選系統(tǒng)中的可見光成像改為熒光成像，通過對以旋轉下滑狀態(tài)逐個、順序通過背景板前的帶衣花生米進行多次或連續(xù)紫外——熒光成像，獲取污染超限粒的專屬光學信號，并據(jù)此轉換為執(zhí)行信號，即可將黃曲霉毒素超限的帶衣花生米從加工前的原料中剔出。

圖1　帶衣花生米逐粒分選系統(tǒng)方案圖Fig.1 Sorting system of single peanut

本文擬通過測定、比較污染黃曲霉毒素帶衣花生米表面的紫外——熒光光譜[30]，分析其紫外——熒光特性，并通過搭建熒光成像系統(tǒng)，獲得污染黃曲霉毒素帶衣花生米的紫外——熒光圖像，經過適當?shù)霓D換和分析，獲得污染黃曲霉毒素帶衣花生米的專屬熒光信號，以此作為帶衣花生米在線、無損、逐粒分選的判別依據(jù)，實現(xiàn)加工前污染黃曲霉毒素帶衣花生米的剔除。

1　材料與方法

1.1樣品的采集

檢測用帶衣花生米為花28（產地：山東費縣；收獲時間：2012年）。依據(jù)花28的生物特征（表皮顏色、幾何結構），挑選100粒外觀具有代表性的帶衣花生米作為檢測樣本。

1.2帶衣花生米熒光光譜分析

100粒檢測樣本的熒光光譜采用Cary Eclipse熒光分光光度計（美國VARIAN公司）測定。以穩(wěn)定性、重合度及分辨率為依據(jù)選定的Cary Eclipse熒光分光光度計檢測參數(shù)為：激發(fā)光波長365 nm，發(fā)射波長范圍為400～600 nm，狹縫均置為5 nm，掃描速度置為medium,電壓設為600 V。對樣品表面進行周向6點熒光發(fā)射光譜掃描，以6點平均熒光強度繪制熒光發(fā)射光譜[31]。

1.3帶衣花生米黃曲霉毒素超限檢測

依據(jù)免疫親和層析凈化熒光光度法（GB/T18979—2003）進行帶衣花生米黃曲霉毒素超限檢測。在檢測過程中為實現(xiàn)黃曲霉毒素提取液免疫親和柱恒流純化，自制了恒流定量過柱系統(tǒng)（圖2）：利用絲杠副將步進電機的旋轉運動轉換為注射器柱塞的直線運動，通過控制步進電機轉速和轉角間接控制進樣器進樣流量及體積。進樣流量調整范圍：0～333 mL /min。

圖2　恒流定量過柱系統(tǒng)Fig.2 Liquid flow velocity control system

1.4熒光成像系統(tǒng)搭建及帶衣花生米單色熒光成像

以XSY-1落射熒光顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）為平臺，搭建了帶衣花生米熒光成像系統(tǒng)（圖3）。利用擴束鏡將激發(fā)光斑投射區(qū)域擴充至覆蓋2～3?；ㄉ祝辉贒LCW-L 1.3M USB2.0工業(yè)相機物鏡前配置帶通濾光片，獲取樣品的單色熒光圖像。試驗選定的帶通濾光片為（460±5）nm[26]。

圖3　熒光圖像采集系統(tǒng)示意圖Fig.3 Fluorescence image acquisition system

2　結果與分析

2.1帶衣花生米表面熒光信號檢測確定

對挑選出的外觀具有代表性的100粒帶衣花生米（包括霉變粒和正常粒），以中心波長為365 nm的紫外光激發(fā)，在400～600 nm范圍內掃描得到了其受測樣品的熒光光譜（見圖4）。100粒帶衣花生米熒光光譜見圖4。

將100粒受測帶衣花生米與圖4中各自的熒光光譜比對發(fā)現(xiàn)：具有不同外觀特征的帶衣花生米的熒光光譜差異明顯，并且，表皮具有霉變特征的個體，其熒光光譜大多在420～460 nm范圍出現(xiàn)明顯的熒光峰。依據(jù)100粒帶衣花生米在450 nm處的熒光強度分布，將其分為8組（見表1），每組樣品的黃曲霉毒素采用GB/T18979-2003方法檢測，每組3次重復。

表1　受測樣本分組依據(jù)及分布表Tab.1 Grouped basis and distribution of test sample

按GB/T18979-2003方法，稱取3.4 g硫酸奎寧，用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至100 mL，此溶液在450 nm處的熒光強度相當于20.0 μg/kg的黃曲霉毒素標準溶液，其熒光光譜如圖5a所示。8組受測樣本的黃曲霉毒素免疫親和柱提取液的熒光光譜（每組重復測3次，取其平均熒光強度繪制熒光光譜）如圖5b所示（圖中十字標識點為硫酸奎寧校準液450nm處的熒光強度）。通過對比圖5a和圖5b可以判斷8組受測樣本中黃曲霉毒素含量大于20.0 μg/ kg的樣本組。

圖4　100粒帶衣花生米熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of 100 peanuts

圖5　硫酸奎寧溶液及帶衣花生米（8組）黃曲霉毒素免疫親和柱提取液的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of quinine sulfate solution andsolution extracted from 8 grouped peanuts by immunoaffinity column

由圖4和圖5b可知，帶衣花生米表面熒光光譜及其黃曲霉毒素免疫親和柱提取液的熒光光譜譜形相似，均在420～460 nm有明顯的熒光峰，表明受測帶衣花生米表面產生熒光的物質應為黃曲霉毒素。

通過與硫酸奎寧校準液450 nm處的熒光強度比對可見，除組號1、2外，其余6組樣本在450 nm處的熒光強度均超限值，即黃曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）的含量均大于20.0 μg/kg。表明：利用熒光分光光度計（激發(fā)波長365 nm）檢測450 nm處的熒光強度判定帶衣花生米中黃曲霉毒素限值，與GB/T18979-2003中采用化學方法進行黃曲霉毒素限值的判斷結果存在邏輯關系，即當450 nm處的熒光強度＞30a.u.時，帶衣花生米的黃曲霉毒素含量超過國標限值。

由此可以確定，黃曲霉毒素污染超限的帶衣花生米的特征熒光信號為：在365 nm波長激發(fā)光下，發(fā)射光譜在420～460 nm處有熒光峰；且發(fā)射光譜450 nm的熒光強度＞30。

2.2黃曲霉毒素超限帶衣花生米表面熒光評判的準確率

由于GB/T18979-2003中的免疫親和層析凈化熒光光度法依據(jù)450 nm處的熒光強度判斷帶衣花生米黃曲霉毒素含量是否超限值，因此，以帶衣花生米在450 nm處的熒光強度30為界限將檢測樣品分為兩組，分別得到了其在450/490 nm和460/490 nm處熒光強度比值的箱線圖（見圖6a和圖6b）。

圖6　450/490 nm和460/490 nm熒光強度比值分析Fig.6 Fluorescence ratio of 450/490 nm and 460/490 nm

由圖6a和圖6b可見，450 nm處a.u.＞30和a.u.＜30的帶衣花生米的熒光光譜在450/490 nm和460/490 nm兩處熒光強度比值的中位數(shù)位置、四分位間距框的位置與高度均不重合，說明兩者比值基本不同。根據(jù)Whisker上限和Whisker下限計算出的450/490 nm熒光強度比值的重疊率為19%，表明：應用該方法判別黃曲霉毒素超限帶衣花生米準確率為81%。

2.3黃曲霉毒素超限帶衣花生米單色熒光成像

在熒光圖像采集系統(tǒng)上對污染超限粒進行了單色熒光成像。為修正系統(tǒng)的紅移，強化熒光信號在單色圖像中的表現(xiàn)，單色成像時選用了（460±5）nm的帶通濾光片。成像試驗發(fā)現(xiàn)，受限于熒光圖像采集系統(tǒng)的靈敏度，a.u.＜30的污染超限粒的單色圖像中未見光斑；a.u.＞40的污染超限粒的單色圖像中則會出現(xiàn)形狀不規(guī)整的藍色光斑。

示例選取了光斑具有代表性的9幅污染超限粒的單色熒光圖像，并按光斑亮度和面積劃分為3組（每組3粒，見圖7）。為了考察光斑亮度和面積與熒光光譜的關聯(lián)，在選定檢測參數(shù)下檢測了與9幅單色熒光圖像對應的污染超限粒的熒光光譜（見圖8）。通過圖7與圖8的比對發(fā)現(xiàn)：污染超限粒單色熒光圖像中的光斑面積和亮度，與其在450 nm處的表面熒光強度正相關。

圖7　帶衣花生米單色（460 nm）熒光圖像Fig.7 Fluorescence image of peanuts with 460 nm filter

圖8　污染粒的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra ofcontaminated peanuts

3　結論

本文以帶衣花生米為研究對象，依據(jù)黃曲霉毒素的紫外——熒光特性，判定了黃曲霉毒素超限帶衣花生米的熒光光譜特征；評估了表面熒光法判斷黃曲霉毒素超限帶衣花生的準確率；并對黃曲霉毒素超限帶衣花生米進行了熒光成像。研究結果表明：

1）黃曲霉毒素污染超限的帶衣花生米的特征熒光信號為：在365 nm波長激發(fā)光下，發(fā)射光譜在420～460 nm處有熒光峰，且發(fā)射光譜450 nm的a.u.＞30。

2）依據(jù)帶衣花生米表面熒光特性可有效區(qū)分污染超限粒與正常粒，判斷準確率為81%

3）試驗條件下，a.u.＞40的污染超限粒的單色（460 nm）熒光圖像中會出現(xiàn)明顯的藍色光斑。

4）表面熒光信號可作為帶衣花生米在線、無損、逐粒分選的專屬光學信號，用于黃曲霉毒素污染超限的帶衣花生的剔除。

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Fluorescent signal characteristics for sorting of peanut contaminated by aflatoxion

Wang Yequn, Yang Zengling, Zhang Shaoying※, Liu Ting
（College of Engineering, China Agriculture University, Beijing 100083, China）

Abstract:Peanuts are especially susceptible to contamination of aspergillusflavus and aspergillusparasiticus, which can produce a kind of highly toxic substance, aflatoxin.The study about the separation technology of aflatoxin-infected peanuts before processing can effectively isolate the source of contamination by taking precautions instead of executing treatment on the contamination, thus being of great significance on guaranteeing food safety.For the purpose of effectively eliminating the red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels from raw materials, one technology concept of one-by-one sorting method using the exclusive fluorescent signal of the red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels was conceived here referring to the existing color sorting system.In this study, the fluorescence spectra of 100 red-skin peanut samples with representative appearance were determined using Cary Eclipse fluorescent spectrophotometer（at an excitation wavelength of 365 nm, an emission wavelength in the range of 400～600 nm and discharge voltage of 400 V）.According to the fluorescence intensity distribution of samples at the wavelength of 450 nm, all these 100 red-skin peanut samples were divided into 8 groups.The aflatoxin content for each group of samples was determined using the standard method, GB/T 18972-2003 Determination aflatoxin content in food-Cleanup by immunoaffinity chromatography determination by highperformance liquid chromatography and fluorimeter.By comparing the surface fluorescence spectroscopy of the 8 groups with the obtained results from the standard method, the fluorescence spectroscopy characteristics of the the red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels were primarily determined.The accuracy rate of discriminating the aflatoxin levels of red-skin peanuts using surface fluorescence was evaluated by means of drawing the box-plots of the fluorescence intensity ratio at 450 nm/490 nm and 460 nm/490 nm.Taking the colony laser fluorescence microscope as a platform, and using a laser beam expander that can enlarge the projection area of the excitation light to cover 2-3 peanuts, the fluorescence images of the red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels were taken using a monochrome fluorescence image acquisition system, which was set up by putting a band-pass filter（460±5 nm）at the front of an industrial camera objective.The results of this study showed that there was a correlation between the determination of the aflatoxinlevels in red-skin peanuts by using fluorescent spectrophotometer at an excitation wavelength of 365 nm to detect the fluorescence intensity at 450 nm and the aflatoxin measurement using the standard method, which means that while the fluorescence intensity at 450 nm is greater than 30 a.u., the aflatoxincontent exceeded the national standard limit.Thus, the characteristic fluorescent signal of the excessive aflatoxin contamination can be intended as follows: the emission spectra generate fluorescence peaks at 420～460 nm and the fluorescence intensity at 450 nm was greater than 30a.u., while under an excitation wavelength of 365nm.According to the calculation based on the Whisker upper and lower limit, the overlapping ratio of the fluorescence intensity was at 450 nm and 490 nm is 19%, indicating that the discrimination accuracy rate of red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels was 81%.Meanwhile, using the fluorescence image acquisition system, the monochrome images of the aflatoxin excessive peanuts were obtained, which displayed blue light spot for the contaminated peanuts once the surface fluorescence intensity was greater than 40a.u.Overall, the study indicates that the surface fluorescence signal can be the exclusive light signal of the red-skin peanuts for on-line, nondestructive and one-by-one sorting, for the purpose of eliminating the red-skin peanuts with excessive aflatoxin levels.

Keywords:agricultural products; fluorescence; red-skin peanut; aflatoxin; sorting

通信作者：※張紹英（1961-），男，河北人，教授，博士生導師，主要從事農業(yè)工程裝備研究。北京中國農業(yè)大學工學院，100083。

作者簡介：王葉群（1989-）,女，陜西人，博士生，主要從事農產品加工及貯藏研究。北京中國農業(yè)大學工學院，100083。E-mail：yequnw@163.com

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃資助項目（2012BAD31B09）

收稿日期：2015-07-25

修訂日期：2015-11-12

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6819（2016）-01-0187-06

doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.01.026