仙靈骨葆膠囊TLC鑒別方法研究

祝清燦 徐 東 汪 娥 孫宜春* 段 麗 李慧馨 胡 曉

1.國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 201203

仙靈骨葆膠囊收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》骨傷科分冊，由淫羊藿、續(xù)斷等6味中藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎、接骨續(xù)筋、強(qiáng)身健骨的功效。用于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨關(guān)節(jié)炎、骨無菌性壞死等[1]。近年來，國內(nèi)外對仙靈骨葆膠囊藥理活性和臨床應(yīng)用的研究成果不斷涌現(xiàn)，但對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[WS-10269(ZD-0269)-2002-2011Z]中，僅對淫羊藿、丹參和補(bǔ)骨脂進(jìn)行薄層色譜鑒別，且淫羊藿的鑒別方法斑點(diǎn)拖尾；補(bǔ)骨脂的鑒別方法主斑點(diǎn)Rf值較低；無續(xù)斷和知母的薄層鑒別方法。國家中醫(yī)藥管理局將仙靈骨葆膠囊標(biāo)準(zhǔn)列入中藥重點(diǎn)產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定提升計劃，研究根據(jù)淫羊藿、續(xù)斷、丹參、補(bǔ)骨脂和知母的化學(xué)成分研究結(jié)果[2-6]，對仙靈骨葆膠囊薄層色譜鑒別方法進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，改進(jìn)了淫羊藿、丹參、補(bǔ)骨脂的薄層鑒別方法，提高了方法專屬性，增加了續(xù)斷和知母的薄層色譜鑒別方法，提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ML204-102型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；ZF-7N型智能暗箱式三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；KQ-5000A型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；薄層成像儀(CAMAG Visualizer 2)。

1.2 試藥 淫羊藿苷(批號：110737-202017)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號：111685-201908)，丹參酮ⅡA(批號：110766-201721)、異補(bǔ)骨脂素(批號：110738-201614)、知母皂苷BⅡ(批號：111839-201706)對照品，丹參(批號：120923-201615)、補(bǔ)骨脂(批號：121056-201605)、淫羊藿(批號：121632-201502)、續(xù)斷(批號：121033-201812)、知母(批號：430023-201807)對照藥材，均由中國食品藥品檢定研究院提供。硅膠G預(yù)制板(批號：20180801，青島海洋化工有限公司；批號：1.05626.0001，德國默克公司)?；瘜W(xué)試劑均為分析純；水為純化水。仙靈骨葆膠囊樣品(批號：20180704，20180706，20180708)由國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿、續(xù)斷的鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物1 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液[7]。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 分別取淫羊藿對照藥材、續(xù)斷對照藥材各0.2 g，照2.1.1供試品溶液的制備方法制備淫羊藿對照藥材和續(xù)斷對照藥材溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 分別取淫羊藿苷對照品、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷0.2 mg和川續(xù)斷皂苷Ⅵ 1 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液[8]。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除淫羊藿、續(xù)斷外的其他處方藥味，按照仙靈骨葆膠囊制備工藝制備缺淫羊藿和續(xù)斷的陰性樣品，照2.1.1供試品溶液的制備方法制備缺淫羊藿和續(xù)斷的陰性對照溶液。

2.1.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取上述溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀(8 mm)，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶3∶1.5)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與淫羊藿對照藥材和淫羊藿苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯綠色的熒光條帶[9]。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至條帶顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與續(xù)斷對照藥材和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕色條帶。如圖1所示。

紫外光燈(365 nm)下檢視 日光下檢視

2.2 丹參、補(bǔ)骨脂的鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物4 g，置具塞錐形瓶中，加乙醚50 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液[10-11]。

2.2.2 對照藥材溶液的制備 取丹參對照藥材1 g，照2.2.1供試品溶液的制備方法制備丹參對照藥材溶液。再取補(bǔ)骨脂對照藥材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為補(bǔ)骨脂對照藥材溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 分別取丹參酮ⅡA、異補(bǔ)骨脂素對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含丹參酮ⅡA 0.5 mg、異補(bǔ)骨脂素0.2 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除丹參、補(bǔ)骨脂外的其他處方藥味，按照仙靈骨葆膠囊制備工藝制備缺丹參和補(bǔ)骨脂的陰性樣品，照2.2.1供試品溶液的制備方法制備缺丹參和補(bǔ)骨脂的陰性對照溶液。

2.2.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取上述溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀(8 mm)，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(14∶1∶0.5)為展開劑[12]，展開，取出，晾干，在日光下檢視。供試品色譜中，在與丹參對照藥材和丹參酮ⅡA對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙色條帶。噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液，晾干，置105 ℃下加熱，在紫外光燈(365 nm)下放置5 min左右檢視。供試品色譜中，在與補(bǔ)骨脂對照藥材和異補(bǔ)骨脂素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的天藍(lán)色熒光條帶。如圖2所示。

日光下檢視 紫外光燈(365 nm)下檢視

2.3 知母的鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物3 g，置具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，棄去乙酸乙酯層，合并水層，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌4次，每次20 mL，取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液[13]。

2.3.2 對照藥材溶液的制備 取知母對照藥材0.2 g，照2.3.1供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備 取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?，加甲醇制成? mL含1 mg的對照品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 照仙靈骨葆膠囊處方配比，分別取除知母外的其他處方藥味，按仙靈骨葆膠囊制備工藝制成不含知母的陰性樣品。照2.3.1供試品溶液的制備方法制備知母陰性對照品溶液。

2.3.5 薄層鑒別方法及結(jié)果 吸取供試品溶液3～7 μL、對照藥材溶液5 μL、對照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使成條帶狀(6 mm)，以三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(7∶3.5∶1.0∶0.5)的下層溶液為展開劑[14]，展開，取出，晾干，再以正丁醇-甲酸-三氯甲烷(4∶0.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液-乙醇(1∶6)的混合溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與知母皂苷BⅡ?qū)φ掌泛椭笇φ账幉纳V相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。如圖3所示

1～2.知母皂苷BⅡ?qū)φ掌罚?.知母對照藥材；4～10、13～18.供試品；11～12.知母陰性對照品

3 討論

3.1 供試品溶液制備 根據(jù)化學(xué)成分的溶解性，分別對提取溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水)，萃取溶劑(乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇)，超聲提取時間(10 min、20 min、30 min)，樣品取樣量(0.5 g、1 g、3 g、5 g、7 g)、加入溶劑量(10 mL、30 mL、50 mL)等條件進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以本文中制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點(diǎn)最清晰。

3.2 色譜條件考察 根據(jù)展開樣品主要化學(xué)成分的極性，選擇適用性較廣的展開劑，對展開系統(tǒng)如：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1.5∶4∶0.7)、水飽和的正丁醇、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.15)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶2)、三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶1.5∶0.5)，硅膠板種類(硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板)，點(diǎn)樣量(1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL)，條帶點(diǎn)樣寬度(5 mm、6 mm、7 mm、8 mm)，薄層板預(yù)平衡時間(10 min、20 min、30 min)等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，使用文中所用的色譜條件時，展開效果較好，供試品與對照品及對照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數(shù)較多，分離度較好。

3.3 專屬性考察 分別吸取供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液，進(jìn)行薄層鑒別試驗，根據(jù)擬鑒別化學(xué)成分的化學(xué)性質(zhì)，選用不同的顯色劑顯色，結(jié)果顯示，供試品色譜在與對照品相對應(yīng)位置顯相同顏色的熒光條帶，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置有相同顏色的熒光條帶，陰性樣品無干擾；在日光下檢視，供試品色譜在與對照品色譜相對應(yīng)位置有相同顏色條斑，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置有相同顏色條帶斑，陰性對照無干擾，說明方法的專屬性較好。

3.4 顯色劑的選擇 顯色的順序直接影響薄層鑒別的效果。通過對三氯化鋁乙醇溶液、硫酸乙醇溶液等多種顯色劑和顯色條件進(jìn)行顯色研究。結(jié)果[15]表明，三氯化鋁是一種可逆性的顯色劑，噴三氯化鋁顯色后，被激發(fā)的熒光斑點(diǎn)大多數(shù)是可逆的，顯色檢視完畢后，不影響薄層板再噴其他顯色劑顯色，因此，在進(jìn)行淫羊藿和續(xù)斷的鑒別時，先噴3%三氯化鋁乙醇溶液進(jìn)行淫羊藿鑒別，后噴硫酸乙醇溶液進(jìn)行續(xù)斷鑒別。

綜上，本實(shí)驗利用薄層色譜鑒別技術(shù)，對仙靈骨葆膠囊薄層鑒別方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，根據(jù)擬鑒別化學(xué)成分的化學(xué)性質(zhì)，選用不同的顯色劑顯色，在不同的顯色條件下分別收集顯色信息，從而鑒別不同的藥材，優(yōu)化了淫羊藿、丹參、補(bǔ)骨脂的薄層鑒別方法，增加續(xù)斷、知母的薄層鑒別方法，實(shí)現(xiàn)制備同一供試品，使用同一塊薄層板，同時鑒別兩種不同的藥材，與原標(biāo)準(zhǔn)中的薄層色譜鑒別方法相比，可節(jié)省檢測時間，提高檢測效率。新建的薄層鑒別方法能控制處方中大部分藥味，全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。