白藜蘆醇對膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠甲狀腺激素受體及脫碘酶的影響

郝立月， 段曉梅， 夏淑芳， 李麗婷， 樂國偉， 施用暉*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

同），30 s，延伸72℃，20 s，所有基因均為45個循環(huán)；終末延伸72℃，5 min。

根據(jù)溶解曲線評估RT-PCR產(chǎn)物的特異性。以β-actin內(nèi)參基因，檢測各模板的 Ct值，進(jìn)行相對定量，結(jié)果均為相對于正常組基因的改變量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果均以 x±SD表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并用Tukey檢驗進(jìn)行組間比較，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

白藜蘆醇對膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠甲狀腺激素受體及脫碘酶的影響

郝立月1，2， 段曉梅2， 夏淑芳2， 李麗婷2， 樂國偉1，2， 施用暉*1，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

探討白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素代謝通路中的關(guān)鍵基因SIRT1、PGC1α進(jìn)而緩解機(jī)體氧化應(yīng)激，改善甲狀腺激素及其相關(guān)受體水平，調(diào)節(jié)能量代謝維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。C57雄性小鼠隨機(jī)分成3組，每周監(jiān)測體質(zhì)量，分別測定血脂、甲狀腺激素以及氧化應(yīng)激指標(biāo)。與C組相比，HFD組小鼠體重、血脂顯著升高（P＜0.05）；HFD組小鼠肝臟GSH/GSSG和T-AOC在第7周末顯著降低，MDA顯著上升（P＜0.05）；HFD組T4以及FT4水平與C組相比顯著升高（P＜0.05），T3以及FT3水平差異不顯著；添加白藜蘆醇能顯著上調(diào)DIOI、TRβ、SIRT1、PGC1α的表達(dá)量。

高脂日糧；白藜蘆醇；甲狀腺激素；SIRT1；PGC1α；DIO1；TRβ

甲狀腺激素在調(diào)節(jié)能量代謝過程中扮演重要的角色，研究證明甲狀腺激素能增加氧消耗，其水平異常對機(jī)體代謝率的改變有深遠(yuǎn)影響[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，8周高脂膳食會顯著上調(diào)雄性小鼠促甲狀腺激素釋放激素（TRH）的表達(dá)，升高血清TSH水平，但血清T4和T3的水平維持正常，外周組織中脫碘酶活性以及血清反T3（rT3）水平顯著升高[4]，還有研究表明缺乏TRα的小鼠能抵抗高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖[5]，而敲除間腦中TRH前體能改善高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠血壓的升高[6]。

SIRT1同樣在能量代謝過程中起重要作用。例如在長期饑餓的條件下，SIRT1去乙?；⒓せ頟GC1-α，促進(jìn)脂肪酸的氧化并改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)[7-9]。白藜蘆醇是一種多酚類物質(zhì)，它可以上調(diào)SIRT1的酶活性，用白藜蘆醇處理小鼠能夠抵抗高脂飲食引起的肥胖和代謝綜合征[10]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1與甲狀腺激素受體（Thyroid Hormone Receptors TRs）存在表面重疊部分，在糖異生，脂肪酸氧化，線粒體功能方面呈現(xiàn)部分相輔生理作用[11-12]。而TRβ在甲狀腺激素信號通路中發(fā)揮重要作用，作者意在研究白藜蘆醇能否通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素信號通路關(guān)鍵基因SIRT1以及TRβ，進(jìn)而改善甲狀腺激素代謝紊亂維持機(jī)體正常水平。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

白藜蘆醇：上海諾特生物科技公司產(chǎn)品；7900HT Fast Real-Time PCR儀：ABI公司產(chǎn)品；Trizol裂解液：美國 Biomiga公司產(chǎn)品；熒光染料SBY：Bioneer公司產(chǎn)品；基因引物：上海杰瑞生物工程公司產(chǎn)品；丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.2 動物飼喂及分組

4周齡 C57BL/6雄性小鼠，正常飼料預(yù)飼 1周后，將其隨機(jī)分成3組：正常日糧組（Control）、高脂日糧組（HFD，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%脂肪）以及高脂日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%白藜蘆醇（HFD+Rsv）。小鼠同室分籠飼養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在（23±2）℃，濕度60%，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。

1.3 血樣及組織樣品采集

小鼠實(shí)驗前禁8~10 h，肝素鈉抗凝制備血漿，保存于-80℃冰箱備用。

取肝臟稱質(zhì)量后用預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，拭干后置于冰上，分別迅速放入trizol中，-80℃保存，用于總RNA提取。稱取一定量的肝臟制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的勻漿液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)測定

血漿甘油三酯、總膽固醇及高、低密度脂蛋白含量、丙二醛（MDA）含量、總抗氧化能力（T-AOC）均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。GSH和GSSG含量測定條件采用熒光分光光度法，組織中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定。

血漿三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）以及游離三碘甲狀腺原氨酸 （FT3）、游離甲狀腺素（FT4）和促甲狀腺激素 （TSH）采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）測定，按照廈門慧嘉生物技術(shù)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 肝臟總RNA的提取及轉(zhuǎn)錄

組織中總RNA的提取參照Trizol法，提取后的RNA通過測定260 nm/280 nm吸光度比值檢測其純度，并通過甲醛變性電泳檢測RNA的質(zhì)量。

取2.0 μgRNA，加入dNTP 2.0 μL，OligdT 2.0 μL，70℃水浴 5 min后，至于冰上，加入5RT buffer 5.0 μL，40 U/mL Rnase Inhibitor 0.25 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，DEPC水9.25 μL后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增溫度和時間為：37℃，1.5 h；95℃，3 min。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)時熒光定量PCR

cDNA原液稀釋10倍備用。

RT-PCR反應(yīng)體系 （10.0 μL）如下：cDNA 0.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，SBY green（20 U）5.0 μL，Rox 0.3 μL，無菌水3.4 μL。

PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95℃，5 min；變性95℃，20 s，退火60℃或62℃（不同基因退火溫度不

同），30 s，延伸72℃，20 s，所有基因均為45個循環(huán)；終末延伸72℃，5 min。

根據(jù)溶解曲線評估RT-PCR產(chǎn)物的特異性。以β-actin內(nèi)參基因，檢測各模板的 Ct值，進(jìn)行相對定量，結(jié)果均為相對于正常組基因的改變量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果均以 x±SD表示，運(yùn)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并用Tukey檢驗進(jìn)行組間比較，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 高脂膳食對小鼠體質(zhì)量的影響及白藜蘆醇的干預(yù)效果

小鼠飼喂前，各組體質(zhì)量沒有顯著性（P＞0.05）差異。由圖1小鼠體質(zhì)量變化可知，與C組相比，HFD組小鼠體質(zhì)量在7周顯著 （P＜0.05）升高，與HFD組相比，HFD+Rsv組能夠顯著降低小鼠體質(zhì)量（P＜0.05）。

2.2 高脂膳食對小鼠血脂的影響及白藜蘆醇的干預(yù)

表1為7w小鼠血脂代謝水平情況，血漿甘油三酯（TG）水平、血漿總膽固醇（TCH）各組之間無顯著差異。高、低密度脂蛋白（HDL-C和LDL-C）在第7周與正常組相比，高脂組血漿LDL-C水平出現(xiàn)顯著（P＜0.05）性差異，白藜蘆醇可以降低LDL水平并且升高HDL水平，提示白藜蘆醇可以改善高脂膳食引起的血脂代謝異常。

2.3 高脂膳食對小鼠機(jī)體氧化還原狀態(tài)的影響及白藜蘆醇的干預(yù)

與正常組相比，高脂組小鼠肝臟GSH/GSSG和T-AOC在第7周末顯著降低，MDA顯著上升 （P＜0.05），添加白藜蘆醇可以改善機(jī)體氧化還原狀態(tài)，結(jié)果見表2。

2.4 高脂膳食對小鼠甲狀腺激素水平的影響及白藜蘆醇的干預(yù)

甲狀腺激素水平與機(jī)體代謝水平相關(guān)，由表3可知T3水平各組差異不顯著，高脂組T4水平顯著高于正常組和白藜蘆醇組，高脂組和白藜蘆醇FT3的水平比顯著高于正常組，TSH、FT4水平高脂組與其他組差異顯著。

2.5 高脂膳食對甲狀腺激素信號通路相關(guān)關(guān)鍵基因的影響以及白藜蘆醇的干預(yù)

RT-PCR結(jié)果顯示高脂組TRβ、DIO1mRNA表達(dá)水平下調(diào)，提示高脂膳食條件下TRβ、DIO1可能受到影響，白藜蘆醇能夠上調(diào)TRβ、DIO1mRNA水平。在甲狀腺激素相關(guān)通路中作者研究了SIRT1、PGC1-α。RT-PCR結(jié)果顯示白藜蘆醇能顯著上調(diào)SIRT、PGC1-α，結(jié)果見圖2。

2.6 小鼠代謝情況

圖3為各組小鼠代謝水平情況，高脂組氧氣消耗顯著低于白藜蘆醇組和正常組，高脂組小鼠活動水平低于白藜蘆醇組和正常組但不顯著。

3 討論

研究表明SIRT1能夠減少脂肪組織的積累并且能夠增加肝、肌肉組織脂肪代謝，此外能夠增加糖異生和胰島素敏感性。和SIRT1類似，甲狀腺激素受體TR也與機(jī)體能量代謝水平相關(guān)。研究表明甲狀腺激素發(fā)揮作用需要與受體TR結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因。核受體PGC1α也參與此過程。已有研究表明SIRT1和PGC1α可能結(jié)合T3進(jìn)而加強(qiáng)甲狀腺激素發(fā)揮作用，可以促進(jìn)PGC1α的乙?；?，但此過程需要一定的T3水平[12]。此外SIRT1可作為TRβ的輔助因子，不完全依賴PGC1α乙?；?。由RT-PCR結(jié)果顯示高脂膳食條件下機(jī)體SIRT1、PGC1α、TRβ表達(dá)下調(diào)，添加白藜蘆醇可以改善其mRNA水平。

由代謝實(shí)驗可知高脂膳食條件下，機(jī)體氧氣消耗量顯著降低，白藜蘆醇可以增加機(jī)體耗氧量和活動水平提高小鼠代謝水平。甲狀腺激素與能量代謝水平相關(guān)，高脂膳食條件下TSH水平上升，T4水平顯著高于正常組，T3/T4比率下降，過多的T4不能轉(zhuǎn)換成T3發(fā)揮作用，可能DIO1表達(dá)受到影響。RT-PCR結(jié)果表明高脂膳食條件下肝臟DIO1表達(dá)下調(diào)，甲狀腺激素信號通路受到影響。

綜 上 所 述 ， 由 SIRT1和 PGC1α、TRβ、DIO1mRNA表達(dá)水平可知SIRT1和PGC1α可能與TRβ、DIO1相互作用共同調(diào)節(jié)甲狀腺激素信號通路，添加白藜蘆醇可以改善機(jī)體氧化應(yīng)激程度，改善甲狀腺激素代謝紊亂，從而維持正常的體重及血脂水平。

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Effects of Resveratrol on Thyroid Hormone Receptor and Deiodinase in Mice Fed with High-Fat Diet

HAO Liyue1，2， DUAN Xiaomei2， XIAShufang2， LI Liting2， LE Guowei1，2， SHI Yonghui*1，2
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University；School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The research aimed to study the impact of high-fat diet on thyroid hormone receptor and deiodinase in mice,as well as the protective effect of resveratrol.Four-week-old C57BL/6 male mice were fed normal diet,high-fat diet(HFD),or HFD supplemented with 0.1%resveratrol,respectively, metabolic experiments were conducted in the 6th week,the mice were sacrificed at the end of the 7th week and oxidative stress biomarker,blood lipid and thyroid hormone were then examined.The gene expressions of SIRT1,PGC1α,DIOI and TRβ were analyzed by RT-PCR.Compared with group C,body weight,blood lipid,MDA,T4 and FT4 levels of HFD mice were significantly increased(P＜0.05)whereas liver GSH/GSSG and T-AOC were remarkably reduced.Resveratrol obviously increased the expressions of DIOI,TR beta,SIRT1 and PGC1 alpha.Therefore,in a long term of high-fat feeding,the oxidative stress interfered with thyroid hormone but resveratrol could improve the metabolic abnormality by elevating the expressions of related genes SIRT1、PGC1α、DIOI and TRβ.

high-fat diet，resveratrol，thyroid hormone，SIRT1，PGC1α，DIO1，TRβ

TS 201

A

1673—1689（2016）11—1169—05

2015-01-01

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。

*通信作者：施用暉（1955—），女，上海人，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事營養(yǎng)代謝與控制研究。E-mail：yhshi2009@126.com