靈芝發(fā)酵川芎產(chǎn)物的抑菌性試驗(yàn)

高慧娟， 景 鳳， 潘 媛， 黃金梅， 曹艷茹， 羅 霞， 張芬琴

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000；2.四川省中醫(yī)藥研究院，成都610041；3.甘肅省民勤縣第一中學(xué)，甘肅民勤733000）

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靈芝發(fā)酵川芎產(chǎn)物的抑菌性試驗(yàn)

高慧娟1， 景 鳳3， 潘 媛1， 黃金梅1， 曹艷茹1， 羅 霞2， 張芬琴1

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000；2.四川省中醫(yī)藥研究院，成都610041；3.甘肅省民勤縣第一中學(xué)，甘肅民勤733000）

摘要:目的 研究川芎和靈芎菌質(zhì)粗提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉和黑曲霉供試菌的抑菌作用。方法 用水、75％乙醇、95％乙醇、乙酸乙酯和丙酮等5種溶劑分別對川芎和靈芎菌質(zhì)（靈芝發(fā)酵川芎產(chǎn)物）進(jìn)行提取，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和青霉5種菌作為供試菌，采用濾紙片法測定川芎和靈芎菌質(zhì)粗提液對供試菌的抑菌作用，并用平板稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果 靈芎菌質(zhì)的水和95％乙醇提取液對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用極顯著優(yōu)于川芎（P＜0.01）；75％乙醇和丙酮提取液對大腸桿菌的抑菌作用極顯著優(yōu)于川芎（P＜0.01），對枯草芽孢桿菌的抑菌作用優(yōu)于川芎（P＜0.05）；靈芎菌質(zhì)的95％乙醇提取液對青霉的抑菌作用極顯著優(yōu)于川芎（P＜0.01），丙酮提取液對青霉的抑菌作用優(yōu)于川芎（P＜0.05）；靈芎菌質(zhì)的丙酮和乙酸乙酯提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著優(yōu)于川芎（P＜0.01）。結(jié)論 靈芎菌質(zhì)對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉都具有不同程度的抑制作用且相對優(yōu)于川芎。

關(guān)鍵詞:靈芎菌質(zhì)；濾紙片法；微生物；最低抑菌濃度

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.045

川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）是傘形科多年生草本植物，其性溫、味辛，在我國有悠久的藥用歷史。研究發(fā)現(xiàn)，川芎的提取物具有一定的抑菌殺蟲作用［1］。

以川芎作為生長基質(zhì)，將靈芝菌絲體接種于基質(zhì)之上，靈芝菌體在生長過程中與川芎基質(zhì)相互作用，從而產(chǎn)生新的活性成分和功能物質(zhì)，稱為靈芎菌質(zhì)。已有研究表明，通過雙向固體發(fā)酵技術(shù)制得的靈芎菌質(zhì)，較川芎在活血化淤方面的藥效有較顯著的提升［2］。但靈芎菌質(zhì)在抑菌方面的研究還未見報(bào)道。

本研究將水、75％乙醇、95％乙醇、乙酸乙酯和丙酮等作為溶劑，用超聲方法獲得川芎和靈芎菌質(zhì)提取物，采用濾紙片法測定川芎和靈芎菌質(zhì)粗提液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉和黑曲霉等供試菌的抑菌作用，旨在為藥用菌生物轉(zhuǎn)化中藥材產(chǎn)生的菌質(zhì)的抑菌研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 靈芎菌質(zhì)（靈芝發(fā)酵川芎的產(chǎn)物）；川芎購于四川省德陽市藥店；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（StaPhylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtills）、黑曲霉（AsPergillus niger）、青霉（Penicillum citrinum），購于甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌固體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，PH 7.2～7.4。霉菌固體培養(yǎng)基:新鮮土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，PH 7.2～7.4［3］。1.3 儀器設(shè)備 BT8025B2H型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（深圳永業(yè)昌機(jī)電有限公司）；MJX-160型恒溫培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；DPX-92728-J型霉菌恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CL-32L型高壓滅菌鍋（日本ALP公司）；5A2003型精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）。1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 活化供試菌株 在無菌條件下，用新鮮配制的細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的保藏菌種，37℃下培養(yǎng)24 h，備用；用真菌固體斜面培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接青霉和黑曲霉的保藏菌種，28℃培養(yǎng)72 h，備用［4］。

1.4.2 菌懸液的制備 在活化好的供試菌斜面試管中加入適量的無菌水，倒入有玻璃珠的50 mL無菌生理鹽水中，包扎好后放入搖床振蕩37℃下振蕩30 min［5］。用血球計(jì)數(shù)法，以無菌水制成含菌體數(shù)量為106CFU/mL的菌懸液，置于4℃冰箱內(nèi)保存［6］。

1.4.3 靈芎菌質(zhì)及川芎提取液的制備 取干燥的靈芎菌質(zhì)和川芎，將其研碎到200目，過篩后分別稱取10 g，各加入提取溶劑50 mL，浸泡60 min后，超聲提取2次［7］，每次30 min；過濾，濾渣中再加提取溶劑50 mL，超聲波提取1次，過濾。合并3次濾液，蒸發(fā)濃縮，制成含生藥量為1 g/mL的靈芎菌質(zhì)和川芎提取液。將各溶劑提取液分別稀釋至0.9、0.7、0.5、0.3和0.1 g/mL。靜置30 min后觀察，從開始無沉淀產(chǎn)生的質(zhì)量濃度為測定藥物質(zhì)量濃度。提取液置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?］。

1.4.4 抑菌作用測定

1.4.4.1 濾紙片擴(kuò)散法測定提取液對供試菌的抑制作用將5種供試菌菌懸液各取0.2 mL接種于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，制成含菌平板。把濾紙用打孔器打成直徑5 mm濾紙片，滅菌后將濾紙分別浸泡在無菌水、提取溶劑（水，75％乙醇，95％乙醇，丙酮，乙酸乙酯）、以及川芎、靈芎菌質(zhì)的各種溶劑提取液中浸泡2 h。無菌水浸泡的濾紙作為空白，相應(yīng)的提取溶劑浸泡的濾紙做對照，各濾紙間距離均等，每種處理重復(fù)3次。細(xì)菌置于30℃下培養(yǎng)24 h，真菌置于28℃下培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值［9］，計(jì)算抑菌圈增加率。

抑菌圈增加率=

1.4.4.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定 在無菌條件下取滅菌試管4支，以干藥0.5 g/mL的提取液進(jìn)行二倍稀釋法，稀釋至0.25、0.125、0.0625 g/mL［10］。采用濾紙片擴(kuò)散法測定各供試菌的最小抑菌濃度，以濾紙片周圍剛出現(xiàn)抑菌圈的樣品溶液質(zhì)量濃度為最小抑菌濃度（MIC），各劑量設(shè)定3個(gè)重復(fù)，取最大值［11］。

1.4.5 川芎中粗多糖含有量測定采用蒽酮比色法［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適測定劑量確定 把川芎和靈芎菌質(zhì)的水提取液配置為干藥量為1、0.9、0.7、0.5、0.3和0.1 g/mL，靜置30 min后，≤0.5 g/m L的溶液中無沉淀析出，故而將測試液的最終劑量確定為0.5 g/mL，此劑量的溶液中含有川芎多糖為38 mg/mL。

2.2 川芎和靈芎菌質(zhì)的各提取液對供試菌種的抑菌效果

2.2.1 水提取液對供試菌種的抑菌效果 川芎和靈芎菌質(zhì)的水提液對黑曲霉沒有抑制作用，靈芎菌質(zhì)對枯草桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈增加率分別為（127±7）％；對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用次之，抑菌圈增加率依次為（88±7）％和（93±6）％；對青霉的抑制作用較弱，抑菌圈增加率為（56±10）％。川芎對供試菌的抑菌圈增加率表現(xiàn)的抑制效果是:金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞青霉＞大腸桿菌＞黑曲霉。靈芎菌質(zhì)水提液對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌作用優(yōu)于川芎提取液，且差異極顯著（P＜0.01），對金黃色葡萄球菌和青霉的抑制作用較川芎不明顯。結(jié)果見表1。

表1　水提取液對不同供試菌種的抑菌作用

2.2.2 乙醇提取液對供試菌種的抑菌效果 由于乙醇自身具有明顯的抑菌作用，供試菌無法在乙醇提取液中正常生長，采用75％和95％乙醇提取，將提取液中酒精揮發(fā)干后濃縮，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)［10］。

川芎和靈芎菌質(zhì)的乙醇提取液對黑曲霉也沒有抑制作用，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈增加率較大，對大腸桿菌次之，對青霉的抑菌圈增加率最小。

75％和95％乙醇的川芎提取液對其他四種供試菌的抑菌效果為:金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞青霉＞黑曲霉，這和唐杰等人川芎醇提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較大腸桿菌好的結(jié)果一致［1］；而靈芎提取物對其他供試菌的抑制效果為:枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞青霉＞黑曲霉。靈芎菌質(zhì)75％乙醇提液對大腸桿菌的抑制作用優(yōu)于川芎提取液，且差異極顯著（P＜0.01），對枯草芽孢桿菌抑制作用優(yōu)于川芎提取液（P＜0.05），靈芎菌質(zhì)95％乙醇提取液對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和青霉的抑制作用優(yōu)于川芎，且差異極顯著（P＜0.01），對金黃色葡萄球菌抑制作用較川芎不明顯。結(jié)果見表2和表3。

表2　7 5％乙醇提取液對不同供試菌種的抑菌效果

表3　9 5％乙醇提取液對不同供試菌種的抑菌效果

2.2.3 丙酮提取液對供試菌種的抑菌效果 川芎和靈芎菌質(zhì)的丙酮提取液對黑曲霉同樣沒有抑制作用，對其他4種供試菌均有不同程度的抑制作用。川芎的丙酮提取液和靈芎菌質(zhì)提取液的抑菌圈增加率均為:枯草芽孢桿菌＞青霉＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞黑曲霉。靈芎菌質(zhì)提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用優(yōu)于川芎，且差異極顯著（P＜0.01），對枯草芽孢桿菌和青霉的抑制作用優(yōu)于川芎的（P＜0.05），結(jié)果見表4。

表4　丙酮提取液對不同供試菌種的抑菌效果

2.2.4 乙酸乙酯提取液對供試菌種的抑菌效果 川芎和靈芎菌質(zhì)的乙酸乙酯提取物對黑曲霉沒有抑制作用，對其他4種供試菌有不同程度的抑制作用。川芎提取液和靈芎菌質(zhì)提取液的抑菌圈增加率大小依次為:大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞青霉＞黑曲霉。靈芎菌質(zhì)提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較川芎差異顯著（P＜0.01）。結(jié)果見表5。

表5　乙酸乙酯提取液對不同供試菌種的抑菌效果

2.3 最低抑菌濃度試驗(yàn)(MIC) 通過對靈芎菌質(zhì)的水提液，醇提液、丙酮提取液和乙酸乙酯提取液的抑菌性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)靈芎菌質(zhì)的抑菌圈增加率均高于川芎。丙酮的靈芎菌質(zhì)提取液對4種供試菌的抑菌圈增加率較川芎的差異性顯著，而靈芎菌質(zhì)的其它提取液對4中供試菌，只有部分菌的抑菌圈增加率較川芎的差異性顯著，故而選擇丙酮提取液進(jìn)行4種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）進(jìn)行試驗(yàn)，得到丙酮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和青霉的最低抑菌濃度分別為0.125、0.25、0.25和0.5 g/mL。結(jié)果見表6。

表6　靈芎菌質(zhì)的丙酮提取液的M I C實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果和討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明川芎和靈芎菌質(zhì)的水、醇、丙酮和乙酸乙酯提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉均有不同程度的抑制作用；靈芎菌質(zhì)提取液對供試菌的抑菌圈增加率均大于川芎的，且對部分菌的抑制作用較川芎顯著。說明經(jīng)靈芝發(fā)酵川芎，靈芝菌絲體中的酶改變了川芎中的化學(xué)物質(zhì)，增強(qiáng)了川芎中的藥效，提升了川芎本身的抑菌作用。經(jīng)過靈芝生物轉(zhuǎn)化川芎中的具體物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

靈芎菌質(zhì)的不同提取液對同一種菌的抑制作用也不同，對大腸桿菌的抑菌圈增加率最大的是乙酸乙酯提取液，為116％，丙酮提取液中抑菌圈增加率為28％，在水和醇提液中的抑菌圈增加率相差不大，在95％左右；對枯草芽孢桿菌的抑菌圈增加率在95％乙醇提取液中為161％，在75％乙醇、水、丙酮和乙酸乙酯提取液中依次為159％、127％、104％和65％；對金黃色葡萄球菌的抑菌圈增加率在95％乙醇、75％乙醇、水、乙酸乙酯和丙酮提取液中依次為120％、107％、88％、56％和53％；對青霉的抑菌圈增加率在丙酮、95％乙醇、75％乙醇、水和乙酸乙酯提取液中依次為64％、63％、63％、56％和43％；說明不同極性溶劑提取液中所含的物質(zhì)成分不同，對各種供試菌抑制的有效部位不同，會(huì)產(chǎn)生不同的抑菌效果。

川芎經(jīng)過靈芝的發(fā)酵作用得到的靈芎菌質(zhì)，不僅擴(kuò)大了川芎自身的應(yīng)用領(lǐng)域，而且為靈芎菌質(zhì)作為抑菌物質(zhì)提供了科學(xué)理論依據(jù)，對藥物菌質(zhì)的研究開發(fā)具有重要的意義，使其具有更廣泛的開發(fā)利用前景。

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作者簡介:高慧娟（1977—），女，碩士，副教授，主要從事微生物發(fā)酵與食品工程方面的研究。Te1: 18209460218，E-mai1: gaohuijuan2007@126.com

基金項(xiàng)目:甘肅省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（1506RJGZ050）；河西學(xué)院校長基金項(xiàng)目（XZ2014-30）；四川省青年科技基金項(xiàng)目（08ZQ026-14）

收稿日期:2014-10-10

中圖分類號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號(hào):1001-1528（2016）02-0434-04