HPLC法測定生甘草、炙甘草中6種成分

周 倩， 戴衍朋， 王 亮， 郭 威， 周洪雷

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014）

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HPLC法測定生甘草、炙甘草中6種成分

周 倩1，2， 戴衍朋2， 王 亮2， 郭 威1，2， 周洪雷1*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟南250014）

摘要:目的 建立HPLC法測定生甘草、炙甘草中5個黃酮（甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素）和一個三萜類（甘草酸銨）成分的含有量。方法 甘草甲醇提取液分析采用HyPerc1one ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；乙腈-0.2％甲酸為流動相，梯度洗脫；柱溫25℃。結(jié)果 與生甘草相比，炙甘草中甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、甘草酸銨、異甘草苷的含有量均有所下降，其中前3個成分降低程度較為明顯。結(jié)論 甘草蜜炙過程中苷類成分發(fā)生了水解，由于其極性較低，導(dǎo)致難以煎出，故甘草素、異甘草素的含有量未明顯升高。

關(guān)鍵詞:生甘草；炙甘草；黃酮；三萜；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.031

KEY W 0RDS: raw Radix glycyrrhizae；baked Radix glycyrrhizae；f1avonoid；triterPene；HPLC

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根莖［1］，根據(jù)臨床需要，常分別以生甘草和炙甘草兩種飲片規(guī)格入藥［2］。其中，生甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛和調(diào)和藥性的功效，而蜜炙后則以補脾和胃、益氣復(fù)脈為主。中藥炮制后藥效發(fā)生改變的根本原因是炮制引起了中藥化學(xué)成分的變化，查閱文獻發(fā)現(xiàn)，對甘草成分分析以及蜜炙前后化學(xué)成分的差異雖有不少報道［3-8］，但是大多以有機溶劑（不同濃度甲醇、乙醇等）為提取溶媒開展研究，而臨床上生甘草、炙甘草飲片均是以水煎液入藥，因此并不能很好地反映臨床生熟異用的藥效特點。本實驗針對上述不足，根據(jù)臨床用藥特點，選取甘草主要活性成分［9-12］黃酮和三萜皂苷類成分中的多個成分作為對照，對甘草水煎液中的檢出成分進行了含有量測定的方法學(xué)研究，同時還對生甘草、炙甘草中成分的含有量進行了測定和比較，分析蜜炙對其的影響。

1 儀器和試藥

Agi1ent1200高效液相色譜儀，包括G1315B DAD檢測器；R200D電子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）。乙腈為色譜純；水為超純水；甲醇、甲酸為分析純。

異甘草苷（批號11052613）、甘草素（批號12022207）、異甘草素（批號11041605）均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；甘草素葡萄糖芹糖苷（批號FY19790908）購自南通飛宇生物科技有限公司；甘草苷（批號111610-200604）購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸銨（批號G-003-101105）購自成都瑞芬恩生物科技有限公司。

甘草飲片購自濟南市中魯醫(yī)院藥房（產(chǎn)地內(nèi)蒙古），經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根莖加工而成的飲片。

炙甘草飲片為自制，方法為取甘草片適量，按照《中國藥典》2010年版中的蜜炙法炒至黃色或深黃色，不黏手時取出，晾涼。100 g甘草飲片可炮制得到110 g炙甘草飲片。

2 試驗方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 HyPerc1one ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，15％～25％ A；10～20.3 min，25％～30％ A；20.3～50 min，30％～55％ A）；體積流量為0.5 mL/min（0～10 min）、0.8 mL/min（10.1～50 min）；檢測波長為276 nm（0～14.5 min）、360 nm（14.5～20.3 min）、248 nm（20.3～50 min）；柱溫為25℃。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取甘草飲片粗粉1.2 g，置于圓底燒瓶中，加水回流提取兩次，加水量分別為50和30 mL，分別提取1 h和30 min，濾過，合并濾液，加水定容至100 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含甘草素葡萄糖芹糖苷0.313 6 mg、甘草苷0.176 8 mg、異甘草苷0.161 6 mg、甘草素0.076 mg、異甘草素0.048 mg、甘草酸銨0.172 8 mg的溶液，作為各對照品的貯備溶液。精密吸取1.5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.4 方法學(xué)考察［13-14]

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗考察 精密吸取對照品和供試品溶液各5 μL，依法測定。結(jié)果，對照品色譜峰與其他峰均可達到基線分離；供試品色譜峰中可檢測到甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨6個色譜峰，而且其保留時間和峰形與對照品一致。對照品和供試品的高效液相色譜圖見圖1。

1.甘草素葡萄糖芹糖苷 2.甘草苷 3.異甘草苷 4.甘草素 5.異甘草素 6.甘草酸銨1.1iquiritigenin-7-O-D-aPiosy1-4'-O-D-g1ucoside 2.1iquiritin 3.iso1iquiritin 4.1iquiritigenin 5.iso1iquiritigenin 6.ammonium g1ycyrrhizinate圖1　對照品和供試品的HP L C色譜圖Flg.1 HPLC chrom atogram s of reference substances and sam ples

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品儲備液適量，分別稀釋至0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8倍，制成各對照品的的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣5 μL，測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸。結(jié)果，回歸方程分別為甘草素葡萄糖芹糖苷Y= 6 493X+31.46，r=0.999 6，線性范圍0.007 8～0.250 9 g/L；甘草苷Y=8 353X+14.82，r= 0.999 5，線性范圍0.004 4～0.141 4 g/L；異甘草苷Y=18 255X+2.10，r=0.999 9，線性范圍0.004 0～0.129 3 g/L；甘草素Y=8 813X+0.594，r=0.999 9，線性范圍0.001 9～0.060 8 g/L；異甘草素Y=13 896X-0.564 6，r=0.999 9，線性范圍0.001 2～0.038 6 g/L；甘草酸Y=7 617X+8.63，r=0.999 7，線性范圍0.004 3～0.138 2 g/L，表明以上6個成分均具有良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗 取混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣6次測定。結(jié)果，甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨的峰面積RSD分別為1.1％、1.6％、1.0％、1.2％、1.0％和1.1％，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取甘草供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h測定。結(jié)果，甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨的峰面積RSD分別為1.2％、0.8％、2.2％、2.8％、2.0％和1.1％，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一甘草樣品6份，按“2.2”項下方法制備并依法測定。結(jié)果，甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨的平均含有量分別為0.533％、0.584％、0.065 0％、0.039 2％、0.020 1％、0.920％，RSD分別為1.3％、0.8％、2.3％、2.5％、1.3％和1.1％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 回收率試驗 精密稱取甘草樣品0.6 g，共6份，分別精密加入各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液適量（加入量為基礎(chǔ)值的100％），按“2.2”項下方法提取測定，計算回收率。結(jié)果，甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨的平均回收率分別為97.7％、98.3％、99.0％、100.7％、101.1％和102.3％，RSD分別為2.1％、2.3％、2.3％、3.0％、2.3％和2.1％。同法對炙甘草進行提取測定，結(jié)果6個成分的平均回收率分別為100.6％、100.1％、97.2％、97.9％、99.6％和98.6％，RSD分別為1.5％、2.9％、2.1％、2.2％、2.5％和1.3％，見表1和表2。

表1　生甘草回收率試驗（n=6）Tab.1 Recovery tests for raw Radix glycyrrhizae（n=6）

續(xù)表1　

表2　炙甘草回收率試驗（n=6）Tab.2 Recovery tests for baked Radix glycyrrhizae（n=6）

2.5 甘草及炙甘草水煎液含有量測定 精密吸取生甘草、炙甘草飲片供試品及對照品溶液，各5 μL，注入液相色譜儀，按上述方法和色譜條件測定，計算含有量，結(jié)果見表3。

由表可知，生甘草和炙甘草水煎液中均可檢測到上述成分，兩者圖譜無明顯差異，但成分含有量有所不同。

3 討論

前期對乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.2％甲酸溶液等多個流動相系統(tǒng)進行了比較，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2％甲酸溶液為流動相時，各色譜峰分離度較好，保留時間適中，而且基線穩(wěn)定，方便后期為HPLC/MS分析優(yōu)化色譜條件。由于不同柱溫對分離效果影響不大，因此選擇室溫（25℃）。根據(jù)待測成分的紫外吸收情況，在不同成分出峰時間點選擇適宜波長進行檢測。

表3　生甘草、炙甘草測定結(jié)果Tab.3 Determ lnatlon results of raw and baked Radix glycyrrhizae

生甘草、炙甘草在臨床上以水煎劑入藥，因此采用水作為提取溶劑，更能反映出其與藥效的密切相關(guān)性。通過與對照品色譜圖比較，在生甘草和炙甘草水煎液供試品中可檢測到甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸銨6個成分。方法學(xué)研究結(jié)果表明，在該色譜條件下，HPLC法簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。其中，黃酮苷類成分甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷和以及三萜皂苷甘草酸4個成分的含有量均較高，可作為質(zhì)量評價指標(biāo)來控制甘草飲片的質(zhì)量。

比較生甘草、炙甘草含有量測定結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸銨這4個成分的含有量均有一定程度下降，其中甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷和甘草酸銨降低較為明顯，推測可能是在蜜炙過程中苷類成分發(fā)生了水解。但因水解產(chǎn)物極性較低，水難以煎出，故甘草素、異甘草素的含有量未明顯升高。在今后的研究中，將進一步對其他成分進行定性和定量分析，為解析甘草蜜炙的原理提供科學(xué)依據(jù)。

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Determ lnatlon of slx constltuents ln raw and baked Radix glycyrrhizae by HPLC

ZHOU Qian1，2， DAIYan-Peng2， WANG Liang2， GUOWei1，2， ZHOU Hong-1ei1*
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.Shandong Provincial Academy of ChineseMedicine，Jinan 250014，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for the determination of five f1avonoids（1iquiritigenin-7-O-D-aPiosy1-4'-O-D-g1ucoside，1iquiritin，iso1iquiritin，1iquiritigenin and iso1iquiritigenin）and one triterPene（ammonium g1ycyrrhizinate）in raw and baked Radix glycyrrhizae.METH0DS The ana1ysis was Performed on a HyPerc1one ODS C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），acetonitri1e-0.2％ methanoic acid wasmobi1e Phasewith gradient e1ution，and co1umn temPerature wasmaintained at25℃.RESULTS ComPared with raw Radix glycyrrhizae，the contents of 1iquiritigenin-7-O-D-aPiosy1-4'-O-D-g1ucoside，1iquiritin，iso1iquiritin and ammonium g1ycyrrhizinate in baked Radix glycyrrhizae were decreased，and the former three constituents were reduced more.C0NCLUSI0 N G1ycosides are hydro1yzed in the honey Processing of Radix glycyrrhizae.Because of 1ow Po1arity，they are hard to be extracted，which makes the contents of 1iquiritigenin and iso1iquiritigenin show a 1itt1e increase.

*通信作者:周洪雷（1967—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥及天然藥物的有效成分和質(zhì)量控制。E-mai1: zhouhong1eitcm@163.com

作者簡介:周 倩（1982—），女，博士生，助理研究員，研究方向為中藥及天然藥物的有效成分和質(zhì)量控制。Te1:（0531）82949803，E-mai1: mervei11eqq@163.com

基金項目:山東省自然科學(xué)基金課題（ZR2013HQ029）

收稿日期:2015-06-12

中圖分類號:R284.1

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001-1528（2016）02-0378-05