利用GS3基因功能性分子標(biāo)記改良水稻粒型的研究

李 揚，徐小艷，嚴(yán) 明，馮芳君，馬孝松，梅捍衛(wèi)*

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海200090；2上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海201106）

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利用GS3基因功能性分子標(biāo)記改良水稻粒型的研究

李 揚1，2，徐小艷2，嚴(yán) 明2，馮芳君2，馬孝松2，梅捍衛(wèi)1，2*

（1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海200090；2上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海201106）

摘 要：以長粒品種‘三粒寸’‘IAC1246’‘JAPPENI TUNGKUNGO’和‘MIGA’作為供體親本，以優(yōu)良選系SAGC-4作為受體親本，進(jìn)行雜交和連續(xù)回交，利用GS3基因的功能性分子標(biāo)記SF28進(jìn)行BC1F1和BC2F1的分子標(biāo)記輔助選擇。在不同BC2F1單株派生的BC2F2分離群體中，觀察到粒長性狀的典型雙峰分布或單峰連續(xù)分布。結(jié)合田間農(nóng)藝性狀考察，選出89個具備細(xì)長粒型且綜合農(nóng)藝性狀良好的單株，其中4個優(yōu)良單株的平均粒長從原始受體親本的8" 32 mm增加至9" 84 mm左右，平均長寬比由原來的2" 61增加至3" 00。結(jié)果表明：GS3基因具有控制粒長和長寬比的較大遺傳效應(yīng)，對該基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可快速改良親本的粒型性狀。

關(guān)鍵詞：水稻；粒型；GS3；分子標(biāo)記輔助選擇

水稻是最重要的糧食作物之一，優(yōu)質(zhì)稻的發(fā)展已成為消費者和水稻育種工作者共同關(guān)注的焦點問題之一。提高產(chǎn)量、改良稻米品質(zhì)是水稻育種的兩個主要目標(biāo)，水稻粒型既是重要的稻米外觀品質(zhì)性狀，也與粒重等產(chǎn)量構(gòu)成因素密切相關(guān)。水稻粒型主要通過粒長、粒寬、長寬比和粒厚等4個指標(biāo)進(jìn)行描述，由于世界上大多數(shù)地區(qū)的消費者更偏愛細(xì)長型的稻米［1］，因此提高粒長和長寬比是秈稻品種的重要育種目標(biāo)。

水稻中控制粒長的主效基因GS3已被克隆出來［2］，該基因是粒長和粒重的主效QTL，對粒寬和粒厚只有微效作用。該基因編碼的有功能蛋白表現(xiàn)為粒長的反向調(diào)控因子，在第二個外顯子第165個核苷酸上的C-A單堿基替換，造成編碼蛋白質(zhì)提前終止，具有增加水稻粒長的功能，由此開發(fā)出GS3基因的CAPS功能性分子標(biāo)記SF28［3-4］。然而，GS3基因的調(diào)控模式?jīng)Q定了細(xì)長型谷粒為隱性性狀，該基因的雜合基因型和顯性純合基因型都表現(xiàn)出相同的短粒表型，在連續(xù)回交后代中粒長性狀沒有分離，不能根據(jù)表型直接進(jìn)行選擇，如果逐代自交分離后選擇單株進(jìn)行回交，粒型性狀改良的時間將延長近一倍。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，在水稻幼苗階段進(jìn)行緊密連鎖或者基因內(nèi)共顯性標(biāo)記的基因型檢測，能準(zhǔn)確判斷目標(biāo)基因的雜合及純合基因型，選擇雜合單株在抽穗后與受體親本回交，保證后代中有1/2單株攜帶GS3的長粒型等位基因，通過連續(xù)回交達(dá)到快速改良受體親本粒長性狀的目的。

SAGC-4是上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心通過多親本導(dǎo)入系相互雜交，后代經(jīng)干旱脅迫和不施氮肥大田等條件的鑒定篩選，培育的常規(guī)稻優(yōu)良選系之一。在比爾及梅琳達(dá)蓋茨基金會“綠色超級稻”國際合作項目中，該選系在多個亞洲、非洲國家的試種觀察和多點試驗中，尤其在雨養(yǎng)田試驗中表現(xiàn)突出。但由于該選系的籽粒不夠細(xì)長，在菲律賓等東南亞國家不符合居民的消費習(xí)慣，影響了其在這些國家的審定和推廣。

本研究以長粒品種‘三粒寸’‘IAC1246’‘JAPPENI TUNGKUNGO’和‘MIGA’等作為供體親本，采用分子標(biāo)記輔助回交育種方法，對受體親本SAGC-4的粒型進(jìn)行快速的遺傳改良，以培育在我國、亞洲及非洲國家具有應(yīng)用前景的常規(guī)水稻新品種。

1 材料與方法

1．1 試驗材料與分子標(biāo)記輔助選擇流程

SAGC-4屬中等粒型，用作受體親本；長粒品種‘三粒寸’（中國）、‘IAC1246’（巴西）、‘JAPPENI TUNGKUNGO’（塞內(nèi)加爾）和‘MIGA’（巴西）等作為供體親本。

受體親本SAGC-4分別與上述4個供體親本雜交，標(biāo)記檢測選擇GS3/gs3單株與SAGC-4回交，每個回交群體均進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，選擇GS3/gs3雜合基因型，同時農(nóng)藝性狀與SAGC-4較為相似的單株2次回交后進(jìn)行1次自交，獲得BC2F2分離群體。

1．2 粒型考察和單株選種

2014年冬到2015年春在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南陵水南繁基地大田種植親本和BC2F2群體，成熟后從每個單株上收獲一個穗子上的種子，利用圖像分析系統(tǒng)（SC-G自動考種分析與千粒重儀，杭州萬深檢測科技有限公司）測量籽粒的平均長度和寬度，計算長寬比。

田間結(jié)合粒型、株高、分蘗力、分蘗角度、株葉型、穗型、結(jié)實率等性狀的目測評判，選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、粒型細(xì)長的改良單株，成熟后考察株高、單株有效穗數(shù)、每穗穎花數(shù)、每穗實粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀，其中4個改良單株在株葉型、豐產(chǎn)性等方面表現(xiàn)突出，本研究以此為例分析粒型改良效果。

1．3 分子標(biāo)記分析

采集水稻幼嫩葉片并利用CTAB法［5］快速提取DNA，利用Fan等［4］開發(fā)的SF28標(biāo)記在親本間進(jìn)行多態(tài)性分析，在后代群體間進(jìn)行基因型檢測。

SF28標(biāo)記上下游引物序列分別為：SF28-F（5’-TGCCCATCTCCCTCGTTTAC-3’）；SF28-R（5’-GAAACAGCAGGCTGGCTTAC-3’）。

PCR反應(yīng)體系為：DNA模板（50 ng/μL）2" 0 μL，10×緩沖液（含Mg2＋）2" 0 μL，dNTPs（10 mmol/L）2" 0 μL，引物各0" 5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0" 5 μL，滅菌雙蒸水（ddH2O）12" 5 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行PstⅠ酶切反應(yīng)。PstⅠ酶切體系為：PCR產(chǎn)物8" 0 μL，PstⅠ酶（15 U/μL）0" 1 μL，10×H緩沖液2" 0 μL，滅菌雙蒸水（ddH2O）9" 9 μL。37℃水浴2 h，取8" 0 μL的酶切反應(yīng)終產(chǎn)物在2" 0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測，通過凝膠成像儀觀察和照相。

2 結(jié)果與分析

2．1 親本間的分子標(biāo)記多態(tài)性及后代群體中標(biāo)記檢測效果

利用GS3基因功能性CAPS分子標(biāo)記SF28對供體親本、受體親本進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明：SF28在供體與受體親本間存在明顯的多態(tài)性，在電泳圖譜上酶切條帶具有分子量上的明顯差異，即受體親本的帶型（C）和供體親本的帶型（A）（圖1）。在連續(xù)回交后代中，SF28的擴增和酶切產(chǎn)物呈現(xiàn)兩種帶型，即受體親本SAGC-4的帶型（C）和雜合帶型（H）（圖2）。

圖1　SF28擴增與酶切產(chǎn)物在受體與供體親本間的多態(tài)性Fig．1 Polymorphism of SF28 amplification and digestion products between the recipient and donor parents

圖2　部分BC2F1單株的SF28標(biāo)記檢測結(jié)果Fig．2 DNA bands detected by SF28 marker of some BC2F1plants

2．2 GS3基因的功能分子標(biāo)記輔助選擇

將‘三粒寸’‘IAC1246’‘JAPPENI TUNGKUNGO’和‘MIGA’與SAGC-4分別雜交，利用GS3基因功能性CAPS分子標(biāo)記SF28鑒定F1的真?zhèn)?，GS3雜合型真雜種與SAGC-4回交。在秧苗期進(jìn)行BC1F1群體每個單株的SF28標(biāo)記檢測，選擇具有GS3雜合基因型且田間農(nóng)藝性狀與SAGC-4較相似的單株，在抽穗期與SAGC-4回交。在4個回交組合的BC2F1代群體中篩選GS3基因雜合型且田間農(nóng)藝性狀與SAGC-4較相似的單株，收獲自交種子。在BC2F2代群體中觀察粒長性狀的分離情況，在長粒型單株中根據(jù)田間目測的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，選擇出具備細(xì)長粒型且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株89株。

2．3 BC2F2群體的粒長分離情況

選擇4個不同回交組合在BC2F2代的分離群體進(jìn)行粒長分析（圖3）。來自‘三粒寸’‘IAC1246’與SAGC-4回交后代的14HBL-16和14HBL-27等2個分離小區(qū)中，單株平均粒長的頻率分布呈現(xiàn)典型的雙峰分布。以圖3中雙峰交叉處為分界，左側(cè)的短粒單株數(shù)與右側(cè)的長粒單株數(shù)之間的比例分別為2" 88∶1和4" 13∶1，經(jīng)卡方測驗符合一對基因3∶1的理論分離比，表明在回交群體背景下GS3能夠表現(xiàn)出單個主效基因的效應(yīng)。

圖3　不同回交組合分離群體的粒長頻率分布Fig．3 The grain length frequency distribution of different backcross segregation populations

來自‘JAPPENI TUNGKUNGO’‘MIGA’與SAGC-4的14HBL-42和14HBL-66等2個BC2F2群體中，單株平均粒長的分離情況與前者不同，粒長的頻率分布圖雖然在長粒側(cè)有較長的尾部，但總體上呈現(xiàn)連續(xù)分布（圖3）。造成這一現(xiàn)象的原因可能是群體中除GS3位點之外還同時存在其他控制粒型基因的分離，使得雙峰分布不明顯。

2．4 入選單株的粒型改良效果

從4個不同回交組合中各選擇1個優(yōu)良單株，分別命名為GL1/2、GL1/3、GL1/4和GL1/5（圖4）。從表1可以看出，4個供體親本與輪回親本比SAGC-4粒長分別長1" 5—2" 2 mm，4個改良單株的粒長變化范圍為9" 67—9" 98 mm，均比SAGC-4的粒長極顯著增加，平均為9" 84 mm，比改良前的受體親本SAGC-4提高1" 52 mm。

圖4　親本和改良單株的水稻粒型對比Fig．4 Comparison of rice grain shape between the parents and improved individuals

表1　受體親本、供體親本與入選單株的粒型比較Table 1 Comparison of rice grain shape among the parents and selected individuals

除GL1/4的粒寬有所增加以外，另3個入選單株的粒寬與受體親本相近。4個入選單株籽粒長寬比的變化范圍為2" 99—3" 04，平均為3" 00，比原始受體親本的2" 61增加了0" 39。結(jié)果表明：利用本試驗的4個長粒型供體親本和針對GS3的功能性分子標(biāo)記輔助選擇方法，都可以對受體親本SAGC-4的粒型進(jìn)行有效的改良，保持粒寬基本不變，顯著提高粒長和長寬比，培育SAGC-4的細(xì)長粒型改良系。

3 結(jié)論與討論

GS3是一個控制粒長和粒重的主效QTL，其長粒等位基因廣泛存在于諸多栽培品種中。通過分子育種手段對該基因加以充分利用，不僅可以改善待改良品種的外觀品質(zhì)，而且可以增加粒重、提高產(chǎn)量，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

目前在改良水稻粒型的分子育種中，重要粒型基因的利用還不是非常廣泛，多數(shù)報道都選擇了GS3作為目標(biāo)基因。楊梯豐等［6］和Wang等［7］分別利用單片段代換系和構(gòu)建近等基因系進(jìn)行聚合育種，研究結(jié)果均證實GS3對增加粒長和粒重起到非常關(guān)鍵的作用。方珊茹等［8］利用連鎖標(biāo)記MRG5881和GS09進(jìn)行回交導(dǎo)入法結(jié)合MAS和農(nóng)藝性狀選擇，將GS3長粒等位基因及其他外觀品質(zhì)性狀基因?qū)搿?32B’中，獲得粒長、長寬比和粒重均得到改良的株系。張劍霞［9］利用SF28標(biāo)記的MAS技術(shù)，將GS3的長粒等位基因和Xa23聚合到‘珍汕97B’和‘Ⅱ-32B’中，獲得各自粒長得到改良的株系。本研究利用Fan等［4］開發(fā)的GS3基因功能性分子標(biāo)記SF28進(jìn)行回交導(dǎo)入結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇，從BC2F2代分離群體中直接篩選出長粒表型并且綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的入選單株。從優(yōu)良入選單株的粒型對比結(jié)果來看，不同供體親本對受體親本SAGC-4粒長增加的貢獻(xiàn)基本相同，都可以達(dá)到快速改良SAGC-4粒長和長寬比性狀的目的。與此同時，由于GS3基因不是粒寬和粒厚的主效基因，導(dǎo)入該基因不會改變粒寬性狀，改良單株的籽粒寬度幾乎與受體親本相近，從籽粒外觀品質(zhì)的更高要求來看，可能需要通過后續(xù)改良適當(dāng)降低粒寬，選育具有更為細(xì)長籽粒類型的品種。SAGC-4本身存在株型過于緊束的缺點，在本試驗的BC2F2群體中可以見到分蘗角度和株葉型的廣泛分離，通過對株葉型的目測選擇，大部分入選單株的株葉型比原始受體親本更為適中，有利于形成合理的群體冠層結(jié)構(gòu)。

目前，優(yōu)選的單株將在上海進(jìn)行小區(qū)種植，在正季氣候環(huán)境、高產(chǎn)田間管理條件下進(jìn)行農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量構(gòu)成等鑒定，結(jié)合籽粒外觀和食味品質(zhì)等進(jìn)行下一輪選擇，以獲得比原始受體親本SAGC-4粒長、長寬比顯著增加，農(nóng)藝性狀和豐產(chǎn)性相當(dāng)或者更好的選系，穩(wěn)定后的高代選系將提交后續(xù)品比試驗、病蟲害抗性等鑒定篩選以及國內(nèi)外的測試和示范試種。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］Juliano B O，Villareal C" Grain quality evaluation of world rices［M］" Los Banos：IRRI，1993"

［2］Takano-Kai N，Jiang H，Kubo T，et al" Evolutionary history of GS3，a gene conferring grain length in rice［J］" Genetics，2009，182：1323-1334"

［3］Fan C，Xing Y，Mao H，et al" GS3，a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice，encodes a putative transmembrane protein［J］" Theoretical Applied Genetics，2006，112：1164-1171"

［4］Fan C，Yu S，Wang C，et al" A causal C-A mutation in the second exon of GS3 highly associated with rice grain length and validated as a functional marker［J］" Theoretical Applied Genetics，2009，118：465-472"

［5］Murray M G，Thompson W F" Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］" Nucleic Acids Research，1980，8：4321-4325"

［6］楊梯豐，曾瑞珍，朱海濤，等"水稻粒長基因GS3在聚合育種中的效應(yīng)［J］"分子植物育種，2010，8（1）：59-66"

［7］Wang P，Xing Y，Li Z，et al" Improving rice yield and quality by QTL pyramiding［J］" Molecular Breeding，2011，29（4）：903-913"

［8］方珊茹，吳春珠，劉玉芹，等"分子標(biāo)記輔助選擇改良Ⅱ＿32B的外觀品質(zhì)［J］"分子植物育種，2013，11（6）：673-679"

［9］張劍霞"利用分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)移野生稻增產(chǎn)QTL和聚合水稻優(yōu)良基因［D］"武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009"

（責(zé)任編輯：閆其濤）

Improvement of rice grain shape by functional molecular marker of GS3 gene

LI Yang1，2，XU Xiao-yan2，YAN Ming2，F(xiàn)ENG Fang-jun2，MA Xiao-song2，MEI Han-wei1，2*
（1College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 200090，China；
2Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201106，China）

Abstract：Four donor parental lines with long grain shape，‘SANLICUN’，‘IAC1246’，‘JAPPENI TUNGKUNGO’and‘MIGA’，were crossed with a promising indica rice line SAGC-4 as the recipient parent，followed by continuous backcrosses" Marker-assisted selection was conducted in both BC1F1and BC2F1generations by using the CAPs marker SF28 of GS3 gene" Segregation of grain length showed typical bimodal or continuous distributions in BC2F2populations" A set of 89 individuals were selected based on both grain shape and visual inspection on other agronomic traits" Among them，4 promising individuals had average grain length of 9" 84 mm and length/width ratio of 3" 00，in comparison to 8" 32 mm and 2" 61 of the original recipient parent，respectively" The results indicated that GS3 gene had large genetic effects on both grain length and length/width ratio" Markerassisted selection of the gene could accelerate the improvement of rice grain shape"

Key words：Rice；Grain shape；GS3；Marker-assisted selection（MAS）

*通信作者，E-mail：hmei＠sagc" org" cn

作者簡介：李揚（1989—），男，在讀碩士，主要從事節(jié)水抗旱稻分子育種研究。E-mail：foryli＠163" com

基金項目：比爾及梅琳達(dá)蓋茨基金“綠色超級稻”國際合作項目；上海市科委基礎(chǔ)研究重點項目（12JC1408000）

收稿日期：2015-05-26

文章編號：1000-3924（2016）01-001-05

中圖分類號：S511" 035

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A