抗菌肽在細(xì)菌感染動(dòng)物模型中的抗菌活性和毒性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

黃海鳳，緱三虎，馬銀云，倪京滿(mǎn)

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)研究所，甘肅蘭州 730000)

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抗菌肽在細(xì)菌感染動(dòng)物模型中的抗菌活性和毒性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

黃海鳳，緱三虎，馬銀云，倪京滿(mǎn)*

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)研究所，甘肅蘭州 730000)

摘要：抗菌肽作為新型的潛在抗菌藥物，在耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)峻的今天引起了廣泛關(guān)注。在對(duì)抗菌肽體外研究不斷深入的同時(shí)，抗菌肽體內(nèi)研究也逐漸成為關(guān)注重點(diǎn)。論文主要從抗菌肽的體內(nèi)抗菌活性研究和毒性評(píng)價(jià)兩個(gè)方面進(jìn)行了綜述，在體內(nèi)抗菌活性研究中介紹了模型設(shè)計(jì)及動(dòng)物試驗(yàn)原則、接種途徑和模型鑒定方法，并對(duì)常用于抗菌肽體內(nèi)研究的幾種典型細(xì)菌感染動(dòng)物模型建立及活性試驗(yàn)方法進(jìn)行了總結(jié)，在毒性評(píng)價(jià)中主要介紹了測(cè)定半數(shù)致死量(LD50)法，同時(shí)對(duì)建模及活性毒性評(píng)價(jià)研究中的不同方法進(jìn)行了對(duì)比分析。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；動(dòng)物模型；抗菌活性評(píng)價(jià)；毒性評(píng)價(jià)

感染性疾病的普遍發(fā)生嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，抗生素作為抵抗感染性疾病的一線(xiàn)藥物被廣泛使用。但是，抗生素濫用導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，因此新型抗菌藥物的研發(fā)成為近些年來(lái)的研究熱點(diǎn)。抗菌肽是先天免疫效應(yīng)中的重要成分，廣泛存在于原核生物、植物、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，具有抗菌譜廣、特異性高等生物活性特點(diǎn)，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)宿主免疫的作用，這些特點(diǎn)引起了人們的關(guān)注，并對(duì)其進(jìn)行大量的研究。

縱觀(guān)對(duì)抗菌肽的已有研究，目前大多數(shù)主要集中于體外試驗(yàn)。對(duì)體外研究成熟的抗菌肽必須進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，體內(nèi)研究能夠?yàn)榭咕膽?yīng)用于臨床奠定重要基礎(chǔ)。而目前抗菌肽體內(nèi)研究主要集中于體內(nèi)抗菌活性和體內(nèi)毒性的試驗(yàn)。本文在查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)抗菌肽體內(nèi)研究中的細(xì)菌感染動(dòng)物模型建立、抗菌活性評(píng)價(jià)方法，以及體內(nèi)毒性研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)。

1抗菌肽體內(nèi)抗菌活性研究

通過(guò)抗菌肽體外研究了解其抗菌譜，進(jìn)一步考察其在體內(nèi)的抗菌效果時(shí)，選取并構(gòu)建恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是體內(nèi)活性研究的關(guān)鍵。

1.1模型設(shè)計(jì)及動(dòng)物試驗(yàn)原則

建立細(xì)菌感染動(dòng)物模型時(shí)要遵循以下原則[6]：①相似性：人工復(fù)制的動(dòng)物模型應(yīng)盡可能與人類(lèi)的自發(fā)性細(xì)菌感染相似。②重復(fù)性：理想的感染模型應(yīng)穩(wěn)定、可重復(fù)，甚至可以標(biāo)準(zhǔn)化。③可靠性：模型應(yīng)該能夠反映出臨床上感染情況的病理和癥狀，同時(shí)還要求一定的動(dòng)物數(shù)量來(lái)保證模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④生物安全性：保證不會(huì)造成感染傳播、不會(huì)對(duì)操作人員健康造成威脅，并且可控制。⑤易行性與經(jīng)濟(jì)性：所采用的方法應(yīng)盡量做到容易執(zhí)行和合乎經(jīng)濟(jì)原則。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中，環(huán)境調(diào)控、日常飼養(yǎng)管理及動(dòng)物試驗(yàn)等方面均應(yīng)考慮動(dòng)物福利。同時(shí)，動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)應(yīng)遵循“3R”原則，分別為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)、替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和優(yōu)化動(dòng)物試驗(yàn)方法[7]。

目前，用于抗菌肽體內(nèi)研究的模型動(dòng)物主要是鼠科類(lèi)，而使用最多的是小鼠。由于小鼠個(gè)體小，生長(zhǎng)繁殖快，飼養(yǎng)管理方便，有明確的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，品種和品系多，對(duì)于多種病原體和毒素具有易感性，反應(yīng)極為靈敏，并且遺傳背景研究詳盡，個(gè)體差異小，試驗(yàn)結(jié)果精確可靠，還可根據(jù)試驗(yàn)要求任意選擇品種、年齡、體重、性別等，因此被廣泛采用。

1.2接種途徑

在建立細(xì)菌感染小鼠模型時(shí)，最關(guān)鍵的問(wèn)題是接種致病細(xì)菌，接種量一般因小鼠體重、菌株及接種途徑的不同而不同，在進(jìn)行抗菌肽體內(nèi)活性研究前必須探索出合適的接種途徑和接種細(xì)菌量[8]。目前常用接種途徑有以下幾種：腹腔注射、靜脈注射、皮下接種、鼻腔接種、傷口涂抹接種以及其他特殊方式等。

1.3模型鑒定

細(xì)菌感染小鼠模型的鑒定方法一般通過(guò)在特定時(shí)間對(duì)模型組小鼠進(jìn)行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝脾等器官的病理切片、或細(xì)菌培養(yǎng)等方法來(lái)鑒定[9]，同時(shí)大量文獻(xiàn)一致認(rèn)為若是致死模型，還可根據(jù)模型組小鼠在特定時(shí)間全部死亡來(lái)界定[10-11]。

1.4常用細(xì)菌感染小鼠模型及試驗(yàn)方法

目前文獻(xiàn)報(bào)道中常用于抗菌肽體內(nèi)研究的小鼠主要是ICR鼠、Balb/c鼠、昆明小鼠，其他還有轉(zhuǎn)基因鼠等。

1.4.1急性腹膜炎模型細(xì)菌性腹膜炎是臨床上腹部手術(shù)、創(chuàng)傷或腹腔感染的常見(jiàn)并發(fā)癥，可引起機(jī)體多系統(tǒng)的衰竭最終導(dǎo)致死亡。對(duì)此模型的療效研究，能夠?yàn)榕R床治療提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。急性腹膜炎小鼠模型有3種建立方法，分別為大腸埃希菌致小鼠急性細(xì)菌性腹膜炎、醋酸致小鼠實(shí)驗(yàn)性腹膜炎和腸球菌小鼠毒力相關(guān)性腹膜炎[9]。應(yīng)用于抗菌肽體內(nèi)療效研究時(shí)常用第一種方法。同時(shí)，也可應(yīng)用其他致病細(xì)菌建立模型，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[10]等。

抗菌肽對(duì)小鼠腹膜炎模型療效的試驗(yàn)方法主要有以下兩種：①腹腔注射接種，腹腔注射給藥。如Benincasa M等[10]研究了α螺旋抗菌肽BMAP-27和BMAP-28分別對(duì)大腸埃希菌(Escherichiacoli)、MRSA、P.aeruginosaATCC 27853致小鼠腹膜炎模型的治療效果，首先腹腔注射相應(yīng)致死菌量進(jìn)行感染，然后立即腹腔注射抗菌肽，觀(guān)察小鼠存活情況，發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)小鼠感染性腹膜炎具有顯著的治療效果。該研究采用此方法成功建立3種致病細(xì)菌腹膜炎模型，并應(yīng)用抗菌肽評(píng)價(jià)出其廣譜體內(nèi)抗菌活性。②腹腔注射接種，尾靜脈注射給藥。Wang Y等[11]研究了Anoplin類(lèi)似物Anoplin-4對(duì)E.coliATCC 25922致小鼠腹膜炎模型的治療效果，分別在腹腔注射致死菌量感染后1 h和5 h時(shí)尾靜脈注射抗菌肽高、中、低3個(gè)劑量，每天給藥2次，給藥3 d后觀(guān)察小鼠死亡情況，至第14天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在A(yíng)noplin-4的中、高劑量呈現(xiàn)明顯的抗菌能力且具有劑量依賴(lài)性。該試驗(yàn)方法成功評(píng)價(jià)了Anoplin類(lèi)似物的體內(nèi)抗菌活性，但是尾靜脈給藥方式要求多次給藥，這可能與抗菌肽在血清中易被酶降解有關(guān)。同時(shí)Wang Y等的研究還提示在抗菌肽具有療效的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步探討抗菌肽量效關(guān)系。

以上兩種方法均為腹腔注射感染，僅給藥途徑不同，但都達(dá)到了預(yù)期效果。急性腹膜炎小鼠模型的建立操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定且重復(fù)性好，在抗菌肽體內(nèi)活性研究中被廣泛采用。腹腔注射給藥方式使抗菌肽直接作用于感染部位，起效快且給藥次數(shù)少。而尾靜脈注射給藥方式使藥物直接進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)循環(huán)到達(dá)感染部位，并且預(yù)防感染范圍擴(kuò)大，但是在血清中易被降解或是產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，在測(cè)定抗菌肽抗菌效果時(shí)需根據(jù)其性質(zhì)選擇合適的給藥方法。

1.4.2菌血癥模型菌血癥是指外界細(xì)菌經(jīng)由體表或是感染入口進(jìn)入血液造成的病癥，在機(jī)體血液內(nèi)繁殖并隨血流在全身播散，最終引起全身性感染，并引發(fā)各種炎癥而導(dǎo)致死亡。

小鼠的菌血癥模型也是抗菌肽體內(nèi)研究的常用模型，普遍采用腹腔注射接種和腹腔注射給藥的方法。例如Eriksson O S等[12]選用CD46轉(zhuǎn)基因小鼠，腹腔注射腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)，感染1 h后腹腔注射抗菌肽TP10，分別在治療前和治療后1 h采集血樣進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP10治療前后血液中細(xì)菌量變化與磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組相比明顯不同，顯示出TP10具有短時(shí)間強(qiáng)力抑殺菌作用。該研究中模型建立方法獨(dú)特，采用計(jì)數(shù)細(xì)菌的方法使結(jié)果更加精準(zhǔn)。Tu J C等[13]研究了抗菌肽ZL-2對(duì)ICR小鼠(3周齡，18 g～20 g)E.coilATCC 25922致菌血癥模型的治療效果，首先腹腔注射致死量菌液，然后分別在接種后0.5 h和2 h腹腔注射抗菌肽ZL-2高、中、低3個(gè)劑量，作用4 h后采集血樣，稀釋涂布于BHI瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示抗菌肽組均較PBS對(duì)照組小鼠血液中的細(xì)菌量顯著減少，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。本組對(duì)所設(shè)計(jì)抗菌肽進(jìn)行體內(nèi)活性評(píng)價(jià)時(shí)，選用雌性昆明小鼠(18 g～22 g)，結(jié)合了以上兩個(gè)小組的試驗(yàn)方法，對(duì)感染菌量、給藥時(shí)間、給藥劑量與次數(shù)不斷探索和改善后，成功達(dá)到預(yù)期效果。

抗菌肽對(duì)該模型的作用效果研究通常反映的是抗菌肽短時(shí)間對(duì)細(xì)菌的抑殺作用，腹腔接種的方法建立此模型操作簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定且重復(fù)性好，試驗(yàn)周期短，被廣泛采用。腹腔注射給藥方法直接使抗菌肽作用于感染部位，起效快。動(dòng)物血液中的細(xì)菌量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)體現(xiàn)了動(dòng)物全身性感染程度，也能夠反映出抗菌肽治療作用的強(qiáng)度大小，同時(shí)也是抗菌肽動(dòng)物體內(nèi)量效關(guān)系研究的常用方法之一。

1.4.3傷口感染模型創(chuàng)傷造成各種不同形式的傷口，如裂傷、割傷、刺傷、盲管傷、穿通傷等，會(huì)引起不同類(lèi)型的感染，其感染程度與傷口的大小、深淺、污染程度等密切相關(guān)，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)高熱、昏迷等全身性中毒癥狀。傷口細(xì)菌感染在臨床較為普遍，抗菌肽對(duì)傷口細(xì)菌感染模型的研究一方面能夠?yàn)榕R床研究提供依據(jù)，另一方面能夠拓展抗菌肽體內(nèi)應(yīng)用范圍。

小鼠的傷口細(xì)菌感染模型通常是在小鼠的背部，通過(guò)割、刮或燙的方法建立傷口，然后在傷口處接種細(xì)菌形成感染模型，再采用不同方式應(yīng)用抗菌肽考察其抗菌活性。如Ostorhazi E等[14-15]在雌性CD-1小鼠(20 g～25 g)的背部裸露皮膚處燙傷建立傷口，3 h后在傷口處注射致病量MRSA或K.pneumoniae、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)和奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)的混合菌進(jìn)行感染，然后立即肌肉注射二聚體抗菌肽A3-APO進(jìn)行觀(guān)察，5 d后A3-APO處理的小鼠較模型組表現(xiàn)出顯著改善軟組織和皮膚的狀況，并且采集血樣和切下傷口處皮膚計(jì)數(shù)細(xì)菌后都顯示出細(xì)菌數(shù)量較對(duì)照組顯著減少的現(xiàn)象。隨后，Ostorhazi E等將A3-APO制成涂劑和噴霧劑進(jìn)行給藥，都顯示出比肌肉注射更好的作用效果，其中涂劑的效果最佳。該研究成功建立不同菌種的傷口感染模型，評(píng)價(jià)了抗菌肽廣譜體內(nèi)抗菌活性，同時(shí)研究了抗菌肽的最佳劑型。此外，F(xiàn)eng Q等[16]在ICR小鼠背部用刮刀割的方法建立傷口，涂布金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行感染后，考察了抗菌肽PL-5和鹽酸左氧氟沙星單獨(dú)及聯(lián)合用藥的效果，切下傷口處組織計(jì)數(shù)細(xì)菌,結(jié)果顯示,PL-5和鹽酸左氧氟沙星較未治療對(duì)照組的細(xì)菌數(shù)均有明顯減少現(xiàn)象，且聯(lián)合用藥顯示出更強(qiáng)的治愈效果。Feng Q等在活性評(píng)價(jià)時(shí)引入常用抗生素進(jìn)行對(duì)比，展現(xiàn)出與抗生素相當(dāng)?shù)目咕钚裕饔脵C(jī)制的不同，將大大減小耐藥問(wèn)題發(fā)生的可能性。

綜上所述，該模型為抗菌肽局部作用研究模型，在體內(nèi)作用效果研究中較為直觀(guān)，可以根據(jù)觀(guān)察傷口愈合情況和計(jì)數(shù)傷口處細(xì)菌量變化的方法雙重評(píng)價(jià)體內(nèi)抗菌活性。同時(shí)，該模型適合于抗菌肽劑型和聯(lián)合用藥的體內(nèi)探討，也能夠用于抗菌肽促進(jìn)傷口愈合能力研究。但是這種方法模型穩(wěn)定性和重復(fù)性略差，且對(duì)環(huán)境條件及操作的要求也較高，對(duì)它的使用有一定的限制性。

1.4.4器官感染模型器官細(xì)菌感染在臨床上也較為普遍，大致可分為呼吸系統(tǒng)感染、手術(shù)部位感染、泌尿系統(tǒng)感染、生殖器官感染等。抗菌肽也可應(yīng)用于器官細(xì)菌性感染模型研究。如Cudic M等[17]研究了抗菌肽對(duì)小鼠尿路感染模型的療效。選用雌性CBA/J小鼠(4周齡～8周齡，16 g～18 g)，首先對(duì)Johnson D E等[18]的小鼠尿路感染模型的建立方法進(jìn)行了改善，經(jīng)預(yù)處理后用聚乙烯導(dǎo)管通過(guò)尿道插入膀胱，利用輸注泵輸入E.coilCFT073細(xì)菌懸液進(jìn)行感染，研究了抗菌肽Pip-pyrr-MeArg二聚體通過(guò)尾靜脈、皮下、口服等不同給藥方式的治療效果，計(jì)數(shù)腎臟、膀胱和尿液中的細(xì)菌量后發(fā)現(xiàn)與未治療的模型組相比，抗菌肽組都顯示出一定的作用效果，其中對(duì)腎臟的保護(hù)作用最強(qiáng)。Cudic M等采用輸注法成功建立小鼠尿路感染模型，考察了抗菌肽3種給藥途徑的活性，通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)菌法評(píng)定結(jié)果，達(dá)到預(yù)期目的。同時(shí)，Ostorhazi E等[15]研究了二聚體抗菌肽A3-APO對(duì)痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)導(dǎo)致的小鼠耳朵痤瘡模型的治療作用，通過(guò)局部給藥和肌肉注射兩種方式考察作用效果，觀(guān)察痤瘡大小，結(jié)果均顯示出顯著的治愈能力，其中局部涂抹的效果更佳。Ostorhazi E等在小鼠耳內(nèi)成功建立病理模型，同樣考察抗菌肽不同方式作用效果，發(fā)現(xiàn)直接作用于感染部位的方式效果更好。此外，Mahajan G等[19]研究了抗菌肽PM181104對(duì)雌性Balb/c小鼠(18 g～21 g)由MRSA導(dǎo)致的肺部感染模型和耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(vancomycin-resistant Enterococci，VRE)導(dǎo)致的腎臟感染模型的作用效果，肺部感染模型采用吸入方式接種，腎臟感染模型采用對(duì)預(yù)處理后小鼠尾靜脈注射接種，隨后均采用尾靜脈注射給藥，分別治療2 d和3 d后分離肺部組織和腎臟器官計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未治療的模型組相比抗菌肽組均顯示出細(xì)菌數(shù)量明顯減少的現(xiàn)象。Mahajan G等的研究采用不同方法建立不同細(xì)菌感染的不同器官模型，都采用靜脈注射抗菌肽和細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果的方法，成功評(píng)價(jià)了抗菌肽PM181104的體內(nèi)抗菌活性。

由此可見(jiàn)，抗菌肽的間接給藥方法體現(xiàn)出一定的靶向性，也為抗菌肽在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究提供了依據(jù)。器官感染模型接種方式一般較為特殊，給藥途徑多樣化，但是應(yīng)用時(shí)首先需要評(píng)價(jià)抗菌肽在治療量是否對(duì)目標(biāo)器官有毒性作用，在確保無(wú)毒害后方可試驗(yàn)。此外，抗菌肽對(duì)此模型作用效果的評(píng)價(jià)除了計(jì)數(shù)靶器官細(xì)菌變化情況外，還可以對(duì)測(cè)試器官制成病理切片，通過(guò)觀(guān)察切片的組織細(xì)胞變化情況更直觀(guān)地評(píng)價(jià)抗菌肽的作用效果。但是，該類(lèi)模型的建立對(duì)環(huán)境條件和操作要求較高，甚至要求無(wú)菌環(huán)境，這些條件限制了這種方法的廣泛使用。

1.4.5其他小鼠模型除了以上模型外，抗菌肽體內(nèi)研究還見(jiàn)于其他小鼠模型。如Ghiselli R等[20]對(duì)雄性Balb/c小鼠(25 g～35 g)首先經(jīng)過(guò)結(jié)扎小鼠膽管造成慢性梗阻性黃疸后，腹腔注射大腸埃希菌血清型內(nèi)毒素0111：B4建立內(nèi)毒素血癥模型，然后立即同方式注射抗菌肽BMAP-27及他唑巴坦-哌拉西林，在作用不同時(shí)間后測(cè)定小鼠血液中內(nèi)毒素水平并觀(guān)察小鼠死亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽組較對(duì)照組呈現(xiàn)顯著的作用效果，并且強(qiáng)于他唑巴坦-哌拉西林。Ghiselli R等證明了BMAP-27在體內(nèi)不僅能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而且能夠滅活內(nèi)毒素，這給梗阻性黃疸治療策略提供了新思路。建立類(lèi)似的模型，能夠?yàn)殚_(kāi)辟抗菌肽在體內(nèi)更具專(zhuān)一性的抗菌活性研究奠定基礎(chǔ)。

1.4.6其他動(dòng)物模型目前，抗菌肽的體內(nèi)抗菌活性研究不單局限于鼠類(lèi)，還拓展于其他動(dòng)物模型。例如Yin H等[21]選擇雛公雞作為研究對(duì)象，首先用灌胃的方法接種早熟艾美耳球蟲(chóng)卵囊(Eimeriapraecoxoocysts)建立家禽球蟲(chóng)病模型，隨后立即給抗菌肽LEAP-2和CATHL3[22]，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比抗菌肽組對(duì)球蟲(chóng)病的發(fā)生有明顯改善現(xiàn)象。Yin H等提示抗菌肽LEAP-2和CATHL3在寄生蟲(chóng)促進(jìn)感染傳播或宿主防御衰減感染方面具有一定的改善作用。Heidari M等[23]利用支氣管鏡接種溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)于成年羊肺泡部位，研究了內(nèi)源性陰離子抗菌肽對(duì)M.haemolytica的作用，在0、5、10、20 min時(shí)處死羊取肺泡內(nèi)腔表面細(xì)胞在電鏡下觀(guān)察，結(jié)果顯示內(nèi)源性陰離子抗菌肽能夠迅速附著于細(xì)菌表面使細(xì)菌失活。Heidari M等選用大體格動(dòng)物，更加接近于人類(lèi)，建模方法獨(dú)特，采用電鏡觀(guān)察法評(píng)價(jià)結(jié)果，探索內(nèi)源性陰離子抗菌肽在肺泡內(nèi)的抗菌活性作用。此外，Minardi D等[24]以雄性成熟Wistar大鼠為模型動(dòng)物，研究了抗菌肽Tachyplesin Ⅲ與哌拉西林-他唑巴坦單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)輸尿管支架感染的作用效果，結(jié)果均顯示出顯著的抗菌能力，且聯(lián)合作用更強(qiáng)。Minardi D等的研究模擬細(xì)菌附著于體內(nèi)醫(yī)療材料表面形成的感染情況，這種感染嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)細(xì)菌生物膜形成頑固性感染，顯著的抗菌活性表明抗菌肽Tachyplesin Ⅲ具有抑制體內(nèi)細(xì)菌生物膜形成能力。Aranha C等[25]選擇2月齡的雄性和雌性Holtzman大鼠為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)了抗菌肽Nisin的避孕潛力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nisin具有陰道抗菌和快速殺死精子的雙重活性，提示Nisin可以開(kāi)發(fā)成為一種女性陰道疾病預(yù)防和避孕產(chǎn)品。

綜上所述，選擇雛公雞、羊、大鼠等為模型動(dòng)物能夠用于探索抗菌肽更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。但是，這類(lèi)動(dòng)物模型研究耗資高，操作難度大，穩(wěn)定性低并且實(shí)驗(yàn)條件要求高，可根據(jù)抗菌肽特性探索更廣泛活性時(shí)加以選擇。

2抗菌肽體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)研究

2.1半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

體內(nèi)毒性評(píng)價(jià)是藥物應(yīng)用于體內(nèi)活性研究必不可少的步驟。一般常用于抗菌肽體內(nèi)急性毒性評(píng)價(jià)的方法是測(cè)定LD50。該方法有助于減少所需試驗(yàn)次數(shù)，減少量度極端情況所帶來(lái)的問(wèn)題，也能與最低有效劑量(ED50)結(jié)合計(jì)算出治療指數(shù)。同時(shí)，這個(gè)指標(biāo)能夠直觀(guān)表述藥物的藥效 、毒性或效價(jià)。LD50有多種計(jì)算方法，被普遍采用的是寇氏法和Bliss法[26]。

LD50通常與受試動(dòng)物體重有關(guān)，測(cè)定抗菌肽的LD50一般選用小鼠。LD50越大，表明安全范圍越大。Li Z J等[27]測(cè)定了抗菌肽Hp1404對(duì)雌性Balb/c小鼠(18 g～21 g)通過(guò)腹腔和尾靜脈注射0.4 mL的不同劑量來(lái)評(píng)價(jià)Hp1404在體內(nèi)的急性毒性，結(jié)果顯示腹腔注射80 mg/kg的劑量時(shí)不引起急性不良癥狀，并且受試小鼠全部存活；尾靜脈注射方式的毒性癥狀較為明顯，且通過(guò)寇氏法計(jì)算得到LD50為89.8 mg/kg。此外，de Almeida Vaucher R等[28]用同樣的方法測(cè)定了抗菌肽P34對(duì)雄性Balb/c小鼠口服灌胃途徑的急性毒性，觀(guān)察存活情況至48 h后計(jì)算LD50高于332.3 mg/kg±0.76 mg/kg。同時(shí)de Almeida Vaucher R等還測(cè)定了其慢性毒性，每天灌胃一定量，分別記錄在第0、7、14、21天小鼠血常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)指標(biāo)正?？衫^續(xù)服用。這兩個(gè)小組的研究結(jié)果提示,抗菌肽的腹腔、尾靜脈、灌胃3種途徑中,尾靜脈途徑產(chǎn)生的毒性最大，這說(shuō)明抗菌肽直接進(jìn)入血液循環(huán)會(huì)增加毒性發(fā)生的可能性。因此可以看出，通過(guò)不同方式給藥引起的毒性大小不同。本組對(duì)所設(shè)計(jì)抗菌肽進(jìn)行體內(nèi)急性毒性評(píng)價(jià)時(shí)，采用上述方法，成功評(píng)價(jià)了其腹腔注射方式的LD50。同時(shí)，LD50的大小體現(xiàn)劑量安全范圍，也能夠?yàn)榭咕捏w內(nèi)活性研究中給藥劑量的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

2.2其他評(píng)價(jià)方法

除了上述毒性評(píng)價(jià)方法，還見(jiàn)于其他方法。Aranha C等[25]以評(píng)級(jí)的方法評(píng)價(jià)抗菌肽Nisin在治療量對(duì)雌性Holtzman大鼠反復(fù)陰道內(nèi)給藥的毒性，通過(guò)考察陰道上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和測(cè)定血液中血清生化參數(shù)進(jìn)行毒性評(píng)級(jí)。這種方法通常應(yīng)用于抗菌肽的亞急性毒性考察，可根據(jù)研究目的加以選擇。

抗菌肽的毒性評(píng)價(jià)研究還可以探索并發(fā)現(xiàn)新的作用效果。Gupta R等[29]以果蠅為模型對(duì)象研究了抗菌肽LR14的毒性程度，不斷提高給肽量，通過(guò)觀(guān)察抗菌肽對(duì)果蠅發(fā)育周期、重量及大小的影響程度，發(fā)現(xiàn)LR14在10 mg/mL劑量時(shí)不引起毒性，在10 mg/mL～15 mg/mL時(shí)引起不同程度的毒性，在15 mg/mL以上時(shí)具有了殺蟲(chóng)功效。Gupta R等的研究提示對(duì)抗菌肽體內(nèi)的毒性研究不能局限于評(píng)價(jià)其在作為抗菌藥物時(shí)的不良作用，還可以利用毒性來(lái)開(kāi)發(fā)新的功效，如作為殺蟲(chóng)劑、防腐劑等。

3小結(jié)與展望

在耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重且新的抗生素發(fā)現(xiàn)極其困難的情況下，抗菌肽為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物開(kāi)辟了廣闊的前景，對(duì)抗菌肽的體內(nèi)研究將加快抗菌肽的研發(fā)進(jìn)程。本文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外抗菌肽體內(nèi)研究的動(dòng)物模型建立和抗菌活性、毒性評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展，為抗菌肽體內(nèi)研究提供借鑒，可以根據(jù)抗菌肽的自身特性，以及實(shí)驗(yàn)條件，合理選擇最佳的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行體內(nèi)研究。

抗菌肽的體內(nèi)抗菌效果、毒性評(píng)價(jià)均為基礎(chǔ)研究，還需不斷的拓展和完善。目前，進(jìn)入臨床研究的抗菌肽數(shù)量不斷增加，應(yīng)用前景良好，基礎(chǔ)體內(nèi)研究將為其臨床的吸收、分布及藥代動(dòng)力學(xué)研究提供依據(jù)。另外，抗菌肽的體內(nèi)研究領(lǐng)域在不斷拓展，包括抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和抗腫瘤等各種功效，這將為發(fā)現(xiàn)抗菌肽新功效提供更廣泛的思路。

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Progress on Activity and Toxicity Evaluation of Antimicrobial Peptides in Animal Models of Bacterial infections

HUANG Hai-feng,GOU San-hu,MA Yin-yun,NI Jing-man

(InstituteofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu,730000,China)

Abstract:As novel potential antimicrobial agents,antimicrobial peptides cause widespread concern at the growing problem of drug resistance.While in vitro study of antimicrobial peptides is deepening,studies in vivo has become the focus.We reviewed two aspects including antibacterial activity and toxicity in vivo.In vivo antibacterial activity assessment,principles of model design and experimental animals,vaccination approach and model identification method were mainly introduced.The establishment of typical animal models of bacterial infections and the evaluation methods of antibacterial activity were summarized. In the toxicity assessment,the method of median lethal dose (LD50) was mainly introduced.And different methods about two aspects were compared and analyzed.

Key words:antimicrobial peptide;animal model;antibacterial activity;toxicity

文章編號(hào):1007-5038(2016)03-0103-06

中圖分類(lèi)號(hào):S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：黃海鳳(1989-)，女，甘肅定西人，碩士研究生，主要從事多肽類(lèi)藥物研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273440)

收稿日期：2015-07-01