歐拉藏羊肉成熟過程中Hsp70對細(xì)胞凋亡酶活性的影響

張琛1，李婕1，袁有云2，中拉毛草3，師希雄※1，馬婭俊1，盧得元1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2.甘肅中天羊業(yè)有限公司，3.甘南州動物疾病預(yù)防控制中心）國家自然基金：31460433資助

歐拉藏羊肉成熟過程中Hsp70對細(xì)胞凋亡酶活性的影響

張琛1，李婕1，袁有云2，中拉毛草3，師希雄※1，馬婭俊1，盧得元1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2.甘肅中天羊業(yè)有限公司，3.甘南州動物疾病預(yù)防控制中心）國家自然基金：31460433資助

為了研究歐拉藏羊肉宰后成熟過程中熱休克蛋白 70(heat shock protein 70, Hsp70) 的變化和細(xì)胞凋亡酶（Caspase-3;Caspase-6;Caspase-8；Caspase-9）的活性變化及其相關(guān)性，測定了16只甘南歐拉母藏羊背最長肌肉成熟過程中 Hsp70 的表達量以及細(xì)胞凋亡酶的活性，進一步研究了 Hsp70 與細(xì)胞凋亡酶的關(guān)系。結(jié)果表明：Hsp70表達量總體呈降低的趨勢，宰后0-12h Hsp70 表達量顯著升高（P＜0.05），12-24h Hsp70 表達量顯著降低（P＜0.05），之后不斷下降，宰后168h 達到最小值；Hsp70的表達量與Caspase-8活力值顯著正相關(guān)。證實了Hsp70 與細(xì)胞凋亡酶8之間存在顯著相關(guān)性。

HSP70；細(xì)胞凋亡酶3；細(xì)胞凋亡酶6；細(xì)胞凋亡酶8；細(xì)胞凋亡酶9

藏羊（Tibetan sheep）在海拔3000m以上的高寒生態(tài)環(huán)境中成長，其潔凈的環(huán)境和天然的牧草使藏羊具有廣泛的市場前景[1]。但藏羊的嫩度較差，影響其食用品質(zhì)，因而改善藏羊嫩度是肉品科學(xué)工作者的研究重點[2]。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是指機體受到外界環(huán)境刺激時誘導(dǎo)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的幾族蛋白質(zhì)[3]。Hsp70是目前研究較多的一類熱休克蛋白，具有分子伴侶、細(xì)胞保護、抗細(xì)胞凋亡、免疫等作用，大量研究表明，它能夠直接抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)在和外在路徑[4-5]。但目前Hsp70在藏羊肉成熟過程中對細(xì)胞凋亡酶活性的影響研究還未見報道。

Guillemin[6]通過基因組學(xué)等分析牛肉嫩化的細(xì)胞途徑時發(fā)現(xiàn)，在半腱肌中發(fā)現(xiàn)Hsp70與肉嫩度強負(fù)相關(guān)。Angelo[7]在研究蛋白組學(xué)和基因組學(xué)與母犢牛肉背最長肌嫩度的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，Hsp70含量與牛肉剪切力正相關(guān)，與肌節(jié)長度、肌原纖維小片化指數(shù)（MFI48h、MFI10d）負(fù)相關(guān)；Picard[8]報道，Hsp70是一類能特異性表達、具有抗細(xì)胞凋亡功能的熱休克蛋白，其表達量的下降引起了肉剪切力值的降低。Yang[9]研究報道，用NaN3處理經(jīng)過單層融合、成肌細(xì)胞融合等前處理的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi) Hsp70的表達量增加。

因此，本試驗以16頭2-4歲健康歐拉母藏羊背最長肌肉為研究對象，對其宰后成熟過程中0、24、48、72、120、168h的Hsp70表達量變化和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、 Caspase-9活性進行測定，并對Hsp70表達量變化與細(xì)胞凋亡酶活性進行相關(guān)性分析，以便為藏羊肉成熟機理研究提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗選取2-4歲健康歐拉母藏羊16只的背最長肌作為試驗材料，RIPA組織/細(xì)胞裂解液、PMSF（苯甲基磺酰氟）北京索萊寶科技有限公司（Solarbio）Sheep heat shock protein 70 ELISA kit ,美國BD公司；DC蛋白測定試劑盒美國Bio-Rad伯樂公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀有限公司）；FA2004B電子天平（上海佑科儀器有限公司）；HHS(數(shù)顯式)型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；iMarK全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad伯樂公司）。

1.3 試驗設(shè)計

將選取的藏羊背最長肌肉切割成約50g的小塊，用聚氯乙烯保鮮袋包裝后在0-4℃條件下成熟 0h、24h、48h、72h、120h、168h，在不同的時間點分別取樣，取樣后保存在-80℃冰箱中，用于Hsp70表達量及細(xì)胞凋亡酶活力的測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 Hsp70表達量的檢測

1.4.1.1 蛋白樣品的制備

參考Salokhe[10]的方法將保存于-80℃冰箱中的樣品取出,準(zhǔn)確稱取100mg組織置于研缽中, 加入液氮迅速、充分研磨成粉狀，然后將研磨的組織粉末轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解緩沖液1.0mL(含蛋白酶抑制劑)，勻漿，以充分裂解組織細(xì)胞；將勻漿液移至eppendorf管中, 靜置10min，12000g于4℃離心20min:將上清液移至另一EP管中按照每管200μl分裝, -20℃保存?zhèn)溆?。所有操作均在冰浴中進行。按照試劑盒說明書，將保存于4℃冰箱中的試劑盒取出，室溫下放置30min后，對HSP及內(nèi)參(β-actin) 進行ELISA檢測。

1.4.1.2 Hsp70的定量檢測

參考Yu等[11]的方法采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分析法檢測Hsp70的表達量。將提前保存于4℃冰箱的試劑盒取出，室溫下放置30min后，對Hsp70進行ELISA試驗檢測。用酶標(biāo)儀在450nm下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣品濃度值。

1.4.2 細(xì)胞凋亡酶3活力的檢測

將保存于-80℃冰箱中的肉樣取出，剪碎，加入液氮研磨，稱取0.09g樣品粉末，加入150μL裂解緩沖液震蕩，勻漿,以充分裂解組織細(xì)胞，勻漿液離心15min（10000×g，4℃），取上清液，運用Caspase-3 活性檢測試劑盒和酶標(biāo)儀測定其表達量及活性。

1.4.3 細(xì)胞凋亡酶8活力的檢測

將保存于-80℃冰箱中的肉樣取出，剪碎，加入液氮研磨，稱取0.09g樣品粉末，加入150μL裂解緩沖液震蕩，勻漿,以充分裂解組織細(xì)胞，勻漿液離心15min（10000×g，4℃），取上清液，運用Caspase-8活性檢測試劑盒和酶標(biāo)儀測定其表達量及活性。

1.4.4 細(xì)胞凋亡酶6活力的檢測

將保存于-80℃冰箱中的肉樣取出，剪碎，加入液氮研磨，稱取0.09g樣品粉末，加入150μL裂解緩沖液震蕩，勻漿,以充分裂解組織細(xì)胞，勻漿液離心15min（10000×g，4℃），取上清液，運用Caspase-6 活性檢測試劑盒和酶標(biāo)儀測定其表達量及活性。

1.3.5 細(xì)胞凋亡酶9活力的檢測

將保存于-80℃冰箱中的肉樣取出，剪碎，加入液氮研磨，稱取0.09g樣品粉末，加入150μL裂解緩沖液震蕩，勻漿,以充分裂解組織細(xì)胞，勻漿液離心15min（10000×g，4℃），取上清液，運用Caspase-9 活性檢測試劑盒和酶標(biāo)儀測定其表達量及活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Office Excel 2013繪制折線圖，并用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和相關(guān)性分析，用Duncan 法進行多重比較。

2 、結(jié)果與分析

2.1 藏羊肉成熟過程中Hsp70表達量的變化

圖1 Hsp70表達量的變化

從圖1可以看出，在成熟7天的過程中，藏羊肉熱休克蛋白70表達量總體呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。Hsp70作為分子伴侶，通過結(jié)合受損的以及錯誤折疊的蛋白質(zhì)來保護細(xì)胞內(nèi)蛋白，防止不可逆損傷或聚集，最終導(dǎo)致組織中 Hsp70濃度下降[12]。張淼[13]等研究表明，豬背最長肌在運輸應(yīng)激過程中Hsp70表達量呈現(xiàn)下降的趨勢，本實驗結(jié)果與張淼的結(jié)果相近。藏羊肉在成熟過程中，Hsp70表達量出現(xiàn)短暫的回升，可能由于溶解抑制得以解除造成的。

2.2 藏羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶3活力的變化

圖2 細(xì)胞凋亡酶3活力變化

細(xì)胞凋亡酶3參與對細(xì)胞蛋白的降解并促使細(xì)胞凋亡,被稱為凋亡效應(yīng)因子或細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶。由圖2可以看出，在成熟7d的過程中，藏羊肉細(xì)胞凋亡酶3活力值總趨勢呈現(xiàn)先增大后減小，在0到0.5d細(xì)胞凋亡酶3活力值先稍有增加，0.5d后開始大幅上升，1d時達最大值，在1d到3d其活力值急劇減小，3d時達最小值，之后趨于平穩(wěn)。這與孫志昶[14]得到宰后1d caspase-3活力達最高值結(jié)論基本一致。

2.3 藏羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶6活力的變化

圖3 細(xì)胞凋亡酶6活力的變化

由圖4可以看出，藏羊肉在成熟7d的過程中，細(xì)胞凋亡酶6活性在宰后0d到1d呈明顯上升趨勢，1d時其活力值達最大，之后大幅下降，2d到3d趨于平穩(wěn)，3d至5d有所下降，5d以后趨于平穩(wěn)，第7天達到最小值。這與黃峰[15]研究的凋亡效應(yīng)酶3只能在宰后早期具有活性作用結(jié)論基本一致。

2.4 藏羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶8活力的變化

圖4 細(xì)胞凋亡酶8活力的變化

由圖3可以看出，在成熟7d的過程中，藏羊肉細(xì)胞凋亡酶8活力值在前0.5d大幅度上升，0.5d時達最大值。隨后0.5d到2d大幅度下降，2d后有小幅度上升,從第3d開始總體呈下降趨勢，宰后5d降低程度又減小，7d 達到最小值。

2.5 藏羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶9活力的變化

圖5 細(xì)胞凋亡酶9的活力變化

由圖5可以看出，在藏羊肉成熟7d的過程中，細(xì)胞凋亡酶9活性在宰后0到0.5d呈明顯上升趨勢，0.5d時達最高值，0.5d以后呈明顯下降趨勢，5d后趨于穩(wěn)定。凋亡酶8、9、10只參與細(xì)胞凋亡的啟動,被稱為啟動因子或細(xì)胞凋亡啟動酶。而Caspase-8和Caspase-9活性出現(xiàn)最大值均在宰后0.5d，早于Caspase-3的活力最高點。這與孫志昶(2014)得到的結(jié)果存在分歧，可能與測定方法或物種有關(guān)，但具體原因還有待進一步的驗證。

2.6 Hsp70表達量與Caspase-3 、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9活性的相關(guān)性分析

表1 HSP70表達量與Caspase-3 、Caspase-6、Caspase-8、 Caspase-9活性的相關(guān)性分析

由表1可知，在歐拉藏羊肉成熟過程中，Hsp70的表達量與Caspase-8活力值顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其他酶相關(guān)性不顯著。由此說明，Hsp 70對細(xì)胞凋亡酶8的活性有顯著影響。

3 、結(jié)論

(1)藏羊肉在成熟過程中，藏羊肉熱休克蛋白70表達量值總體呈現(xiàn)減小的趨勢， 7d后降到最小值。

(2)藏羊肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶3、6、8、9的活性隨成熟時間的延長呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。

(3)藏羊肉成熟過程中，Hsp70的表達量與Caspase-8的活力值相關(guān)性顯著（P＜0.05），由此說明，Hsp70表達量對細(xì)胞凋亡酶8的活性有顯著影響。

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