黃河口潮灘春季細菌群落的分布特征及其影響因素研究*

王　凱， 鄒　立**， 高冬梅， 劉　陸

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100; 2. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院， 山東 青島 266100)

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黃河口潮灘春季細菌群落的分布特征及其影響因素研究*

王凱1,2， 鄒立1,2**， 高冬梅1,2， 劉陸2

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100; 2. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院， 山東 青島 266100)

摘要：為研究黃河口潮灘細菌群落結構特征及其影響因素，本文于2012年5月在黃河口口門的潮間帶區(qū)域，以變性梯度凝膠電泳(DGGE)為主要手段，分析了沉積物的生物學信息和主要理化參數(顆粒中值粒徑、總氮、總磷、有機碳和葉綠素a)。結果顯示，研究區(qū)域大致呈現出低有機碳、高營養(yǎng)鹽的環(huán)境特征；DGGE圖譜分析共獲得38個不同位置的條帶；多樣性指數在表層沉積物中變化范圍為2.38～2.64，垂直方向上從表到底逐漸降低(2.45～2.78)。NMDS分析顯示，環(huán)境特征相近的細菌群落，其組成相似性較高。CCA分析中總氮、總磷、有機碳和葉綠素a對細菌群落組成影響顯著。測序結果表明，該區(qū)域優(yōu)勢菌群隸屬變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)，以及一些未分類的生物類群。

關鍵詞：黃河口；潮間帶；細菌群落；細菌多樣性

潮間帶作為陸地和海洋的混合地區(qū)，其物質循環(huán)和能量流動迅速，是海洋生態(tài)系統中極具代表性的部分，也孕育著一群特殊的微生物群落[1-2]。潮間帶微生物作為濕地生物地球化學循環(huán)的重要參與者，在碳、氮、磷和硫循環(huán)中發(fā)揮重要作用[2-5]。此外，潮間帶微生物還能降解一些大分子污染物質，阻止其進入海洋環(huán)境[6]。作為潮間帶生物，微生物響應于多種環(huán)境因子。通常，潮間帶微生物群落與沉積物環(huán)境有機碳[7]和營養(yǎng)物質[7-8]的含量呈現顯著正相關關系，與沉積環(huán)境鹽度和沉積物顆粒粒徑[9]呈負相關關系[10-12]，也會受到潮間帶植被分布[13]的影響。

黃河三角洲是中國暖溫帶保存最完整、最年輕的濕地生態(tài)系統，在世界范圍河口濕地系統中發(fā)育速度最快[13-14,16-17]。黃河口潮灘沉積環(huán)境中細菌豐度相對較低[18]，且受鹽度梯度變化的影響[12,19-20]。微生物在黃河口濕地系統的作用已被關注，包括其在蘆葦濕地中的消化作用[21]，植被根際效應對微生物群落組成的影響[13,21]。而人類活動、石油污染以及土壤鹽漬化，使得黃河三角洲濕地退化嚴重[19,22-24]，并且威脅到微生物繁殖和動植物生長，乃至整個生態(tài)系統的結構和功能[23,25]。

黃河口潮灘的地理位置更接近于海洋，對潮灘環(huán)境微生物群落和功能的認識，是深入研究黃河口及其鄰近海域陸海相互作用的重要內容。本文以聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)為主要手段，研究黃河口潮灘環(huán)境春季細菌群落的分布特征，探討區(qū)域環(huán)境因子對細菌群落結構特征的影響。

1研究區(qū)域和實驗方法

1.1 研究區(qū)域和樣品采集

黃河三角洲位于山東省的東北部(36°55′N～38°12′N; 118°07′E～119°18′E)，其形成主要受黃河的影響。該地區(qū)年平均氣溫在11.7～12.6℃，年降水量為530～630mm，大約70%的降雨發(fā)生在5-8月，同時年蒸發(fā)量卻達到1962mm[13]。本研究區(qū)域春季初級生產力和營養(yǎng)鹽水平都較高[14-15]，因此采樣進行于2012年5月大潮期，采樣斷面位于黃河潮間帶最靠近黃河口的潮灘(見圖1)。在該斷面的高、中、低潮位處依次設置3個采樣站位，記為H、M和L，并在高潮站位H處采集柱狀樣。以無菌方式采集表層沉積物(0～1cm)樣品和柱狀樣(～50cm)。表層樣品裝入無菌袋；柱狀樣在充滿氮氣的試驗箱中從表層到底層，依次以1、2和4cm間隔切割后，裝入無菌袋。所有樣品分成兩份，一份凍存于-4℃用于分析理化參數(顆粒中值粒徑、總氮、總磷、有機碳和葉綠素a)，一份凍于-80℃用于分子生物學分析。采樣同時監(jiān)測沉積物上覆水鹽度信息 (WTW, Multi 340i)。

1.2 分析方法

沉積物顆粒粒徑采用激光粒度儀(Rise-2002)測定；有機碳(OC)和總氮(TN)含量使用PE2400 II型(PE2400 II, UK)元素分析儀測定，檢出限為0.05%；總磷(TP)含量使用堿性過硫酸鉀氧化法[26]，利用QUAATRO型營養(yǎng)鹽自動分析儀(德國BRAN+LUEBBE公司)測定，檢出限為0.01μmol/L；葉綠素a(Chla)含量采用熒光光度法[27]，使用Trilogy型熒光分析儀(Turner Designs, USA)測定，檢出限為0.02μg/L。

(H-高潮位；M-中潮位；L-低潮位。H-High tidal flat; M-Middle tidal flat; L-Low tidal flat.)

1.3 沉積物DNA的提取和PCR擴增

沉積物DNA提取(PowerSoil DNA Isolation Kit, MOBIO, USA)按照試劑盒手冊操作，選用細菌16S rDNA V3區(qū)的通用引物GC-338F和518R，以提取的DNA為模板進行PCR擴增[28]。PCR擴增體系(50μL)：1μLDNA模板，引物GC-338F/518R (20mM)各1μL，5μL10×PCR緩沖液，3.2μLdNTP(2.5mM)，rTaq(5U/μL)聚合酶0.4μL，補滅菌水至50μL。PCR反應使用T-gradient (Biometra, Germany) PCR儀，反應條件為94℃預變性5 min，94℃預變性1 min，55℃復性45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最終72℃延伸10min。

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及優(yōu)勢條帶測序

10μL PCR產物經純化回收(DNA Gel Extraction Kit, OMEGA)后進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)。PAGE(聚丙烯酰胺)膠濃度為8% (w/v)，變性梯度為35%～55%。在1×TAE緩沖液中150V 60℃條件下電泳5 h(Bio-Rad Dcode System, USA)，電泳終止后，采用銀染法染色，Milli-Q水沖洗后，用Gel-Doc2000(Bio-Rad, USA)凝膠成像系統觀察并拍照。

將DGGE凝膠在紫外分析儀的照射下切膠，回收純化(Poly-Gel DNA Extraction Kit, OMEGA Bio-Tek Inc., GA)，以2 μL回收產物為模板，以不帶GC夾的引物進行PCR擴增。將重新擴增后的產物回收、純化(Qiagen, Valencia, CA)，連接pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，搖菌培養(yǎng)，送至上海立菲生物技術有限公司進行測序。所得序列在NCBI中去除嵌合體，將目標序列在NCBI中以BLAST程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16SrDNA序列。測序獲得的序列上傳至NCBI，獲得序列號為：KP122987-KP122992。

1.5 統計學分析

采用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件對DGGE圖譜進行識別?；诨叶戎稻仃?，借助R 3.1.2軟件進行相似性聚類分析，對分析結果進行非度量多維度排序(Non-metric Multidimensional Scaling,NMDS)[29]。采用Shannon-Weaver指數進行多樣性評價，計算公式如下：

其中：在研究細菌群落多樣性中，Pi是泳道條帶的重要性，用Ni/N表示；Ni是條帶的峰值；N是密度曲線中峰值的總和。

Pearson相關性分析用于探討物理化學參數及其與H′指數的關系。典型對應分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)用來分析微生物群落結構與環(huán)境因子的關系。CCA分析以灰度值矩陣和環(huán)境因子為數據進行計算，并進行499次蒙特卡羅置換檢驗(Monte Carlo Permutation Test)，以及判定顯著環(huán)境因子(p<0.05)，使用CANOCO 4.5 (Microcomputer Power, USA)軟件，用包含環(huán)境因子和DGGE樣品的雙排序圖來解釋二者的關系。

2 結果與討論

2.1 黃河口潮灘沉積物理化特性

研究斷面表層沉積物的理化參數如表1所示。OC和TN含量從潮上帶到潮下帶逐漸降低，變化范圍分別為0.19%～0.22%和0.33～0.41mg/g，TP和Chla含量最高值出現在潮中帶，最高值分別為0.17mg/g和4.54μg/g，上覆水鹽度和沉積物顆粒粒徑在表層沉積物中無顯著差異，平均值分別為29.3和38.6μm。垂直方向上(見圖2)，沉積物顆粒粒徑波動較大(中值粒徑范圍為4.5～28.7μm)，這可能與黃河每年攜帶大量泥沙(1.05×

107t)堆積于黃河三角洲河口處有關，其沉積速率快，沉積物混合作用強，使得沉積物顆粒垂直分布上不均勻[30]。TN含量高值區(qū)出現在13～25cm，其中在15和25cm附近出現2個高值，分別為0.46和0.48mg/g，0～15cm之間隨深度增加緩慢減小，從25cm處到底層TN含量逐漸減小至0.20mg/g，總體呈現逐漸降低的趨勢。黃河三角洲濕地TN的垂直變化規(guī)律與此相似[31]，這可能與底棲生物的活動、微生物調節(jié)和氧含量有關[32]，從Pearson相關性分析可知沉積物顆粒粒徑也是影響TN剖面分布的重要因素(r=-0.508,p<0.05)。TP含量的剖面變化特征較為復雜，總體呈現隨深度增加先降后升的趨勢(個別層次異常)，具體表現為在0～6cm之間隨深度增加逐漸增大，在6cm出現最大值(0.36mg/g)，迅速降低至0.13mg/g后又緩慢升高至0.22mg/g，同樣在25cm出現一個高值(0.28mg/g)，25cm至底層逐漸降低到0.13mg/g。OC的垂直分布特征與TP相似，在0～13cm呈S型波動，在13cm處出現一個小高值(0.32%)，迅速下降之后開始緩慢上升，在25cm處達到最大值(0.35%)，25cm之后逐漸降低至0.13%，在底層又有開始升高的趨勢。葉綠素a含量表層最高(1.2μg/g)，由表層至5cm迅速降低至0.05μg/g，在13cm出現一個小高值(0.23μg/g)，直至深層都維持在0.01～0.03μg/g的較低水平。

表1　黃河口潮間帶表層沉積物理化參數狀況

圖2　黃河口潮灘沉積環(huán)境理化參數的垂直分布狀況(干重)

如表2所示，Pearson相關性分析結果顯示，顆粒粒徑(MD)與H′指數呈極顯著相關關系，總磷(TP)和有機碳(OC)與H′指數呈顯著相關關系，總氮(TN)、總磷(TP)和有機碳(OC)的空間分布都與調查區(qū)域顆粒粒徑(MD)呈現較好相關關系，有機碳(OC)與總氮(TN)極顯著相關，與總磷(TP)顯著相關。

2.2 微生物DNA的PCR-DGGE圖譜

20個樣品共計獲得38個條帶(見圖3)。其中表層沉積物共獲得24個不同位置的條帶，條帶數范圍為18～21，條帶數最多出現在潮中帶(M)，最低出現在潮下帶(L)。垂直方向上，條帶數隨深度增加而逐漸減少，說明微生物多樣性由表層向深層逐漸降低。出現次數超過10次的條帶一共有9條，其中條帶13、22和34出現16次，條帶11出現14次；條帶30主要出現在0～27cm層，條帶20主要出現在27～48cm層，說明微生物群落組成在垂直方向上發(fā)生較明顯的改變。

表2　沉積物理化特性與多樣性指數的Pearson相關性分析(n=20)

注：*:表示在0.05水平上顯著相關，**:表示在0.01水平上顯著相關。Significant values reported as:*:P<0.05; **:P<0.01.

(H-高潮位，M-中潮位，L-低潮位。H-High tidal flat; M-Middle tidal flat; L-Low tidal flat.)

圖316S rRNA PCR產物的DGGE分析譜圖

Fig.3DGGE of 16S rRNA amplification fragments

and bands isolated for sequencing

2.3 細菌群落的優(yōu)勢門類

測序結果顯示，黃河口潮灘春季的優(yōu)勢細菌為Proteobacteria(條帶11和20)，Acidobacteria(條帶13)以及一些未分類的微生物類群(條帶22、30和34)。Proteobacteria中，Gammaproteobacteria(條帶20)和Deltaproteobacteria(條帶11)廣泛分布于海洋和潮間帶環(huán)境[2,33-35]。其中，Gammaproteobacteria作為初級生產者參與潮間帶環(huán)境的氮循環(huán)[36]和CO2的固定[37]。Deltaproteobacteria則與潮間帶硫還原作用相關[2]。測序結果中還發(fā)現Acidobacteria為優(yōu)勢類群之一，報道稱Acidobacteria多見于淡水環(huán)境[2,38]，但并不是其所有亞門都表現出一樣的分布特征，部分亞門在海洋和潮間帶沉積環(huán)境中廣泛存在，如Gp10、Gp21、Gp22和Gp26[36]。有研究認為，Acidobacteria的存在可能與pH有關，當pH<5.5時Acidobacteria的豐度較高[38]，但是也有非酸性環(huán)境沉積物中發(fā)現較多Acidobacteria的現象[1,39]。本文研究區(qū)域沉積環(huán)境屬于鹽堿土，為非酸性環(huán)境，亦發(fā)現Acidobacteria存在。

2.4 潮灘細菌群落結構特征

黃河口潮間帶表層沉積物H′范圍為1.38～2.60(均值2.57)，由潮下帶、潮中帶至潮上帶逐漸降低。H′由表層到深層呈逐漸降低的趨勢(見圖4)；表層最高為2.88，次表層迅速降低至幾乎最低值，之后至20cm附近一直維持較低水平，25cm附近H′再次升高至2.80，之后逐漸降低至較低的2.45。細菌群落的NMDS分析結果顯示(見圖5)，樣品的空間差異明顯。樣品主要分為3個組，樣品H、M和L表現出較高的相似性，聚類位置較為接近。柱狀樣中，2～16cm主要分布在第四象限，聚類位置較為接近；16～48cm作為第3組，主要分布在第1和第2象限。

圖4　黃河口潮間帶沉積物細菌群落多樣性指數

圖5　黃河三角洲細菌群落的NMDS分析

2.5 沉積物理化性質對細菌群落結構的影響

采用CCA分析沉積物理化特征與細菌群落結構的關系，結果如圖6所示。前兩個排序軸一共解釋了21.8%的物種信息。其中TN、TP和OC與第一排序軸呈現較好相關關系，相關系數分別為0.708，0.619，0.581，Chla與第二排序軸呈較好相關關系，相關系數為0.797。氮元素對細菌群落特征有重要指示作用，并作為主要成分影響著黃河口潮灘微生物群落的組成和分布[7,40]。本研究中沉積物TN含量較高，均值為0.37mg/kg；其從表到底逐漸降低，與細菌群落多樣性的變化趨勢相似。

TP亦是影響細菌群落組成和分布的主要因素，與細菌群落的組成差異之間關系密切[8]。研究區(qū)域沉積物TP含量變化范圍為0.12～0.36mg/kg(均值為0.19mg/kg)，從前人研究可知，該區(qū)域中可生物可利用性磷占總磷的比例為6%～24%[41]，它們對維持該區(qū)域底棲藻類和微生物的生長和繁殖有重要作用。Pearson相關性分析也表明，本研究區(qū)域TP與H′之間存在較好相關關系(r=0.492，p<0.05)，表明TP與TN一樣，是影響該區(qū)域細菌結構和多樣性的主要因素。

OC作為微生物生長的物質和能量基礎，是影響和控制沉積物細菌群落組成的基本要素[7,42-44]。研究區(qū)域的OC含量較低，表層含量約為0.3%～0.7%，次表層以下含量小于0.4%。其與第一排序軸表現出較好的相關性(r=0.581，p<0.05)，表明，隨著沉積物深度增加OC含量逐漸降低，其對細菌群落的影響越來越顯著。濕地環(huán)境OC與細菌群落的關系大多如此[7]。

Chla通常用來表征區(qū)域生物現存量和現場初級生產力狀況，研究區(qū)域葉綠素a的分布特征與OC大體一致。CCA分析結果顯示，Chla與第二排序軸相關性較好(r=0.797,p<0.05)，尤其是對H、M、L、和Z1 4個表層樣品的影響最為顯著，表明黃河口潮灘的現場生產碳源可能是細菌再生產的主要碳源，進而影響該區(qū)域細菌生長和群落結構，這一現象和結果在海洋環(huán)境中也有報道[45]。

(MD-顆粒中值粒徑，TN-總氮，TP-總磷，OC-有機碳，Chla-葉綠素a，*表示該因素顯著性小于0.05。MD-sediment grain size; TN-total nitrogen; TP-total phosphorous; OC-organic carbon; Chla-chlorophylla. * means significant variables (p<0.05.)

圖6DGGE圖譜的典型對應分析

Fig.6Canonical correspondence analysis

biplot of DGGE fingerprints

3結論

黃河口潮灘是黃河和渤海相互作用的最前沿，本文于2012年5月，通過PCR-DGGE，研究黃河口潮間帶泥灘環(huán)境細菌群落的分布特征，以及環(huán)境因子對其影響。主要結論如下：

(1) 黃河口潮灘春季細菌群落組成相對復雜，潮灘表層細菌群落多樣性從潮上帶到潮下帶逐漸增大，隨深度的增加多樣性指數逐漸降低；

(2) 細菌群落的優(yōu)勢門類為變形菌門、酸桿菌門以及一些未確定分類地位的微生物類群，主要為海洋環(huán)境的常見門類；

(3) TN、TP、OC和Chla是影響細菌群落結構的主要因素，而細菌群落多樣性與MD、TP和OC表現出較好相關性；其中OC在細菌群落結構的垂直分布上影響更為顯著，現場生產的有機碳可能是細菌活動的主要碳源和影響因素。

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責任編輯龐旻

Characteristics of Bacterial Community and Associated Environmental Impacts in Intertidal Mudflat of Yellow River Estuary, China

WANG Kai1,2, ZOU Li1,2, GAO Dong-Mei1,2, LIU Lu2

(1. The Key Lab of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

Abstract：In order to study the bacterial community composition and distribution in the intertidal mudflat of the Yellow River Estuary (YRE), and issue the associated environmental factors, samples were collected in the high (H), middle (M) and low (L) tide lines in May, 2012, where was close to the mouth of Yellow River. Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) was applied to obtain the bacterialinformation, sediments were also evaluated physical and chemical properties [i.e., sediment median grain size (MD), total nitrogen (TN), total phosphorus (TP), organic carbon (OC) and chlorophyll a (Chl a)]. Results showed that, the investigated section presented a pattern of high nutrients and low organic carbon. A total of 38 bands were indentifiedfrom DGGE gel, the diversity index ranged at 2.38～2.64 in surface sediment, and decreased from surface to deep layers (2.45～2.78). NMDSresults revealed thathigher similarity on bacterial community composition existed in more comparable environments, indicated by the closer position in clustering analysis.The first two CCA ordination axes suggested that bacterial community structure was strongly correlated with environmental variables [i.e., TN, TP, OC and Chla](F=1.38, p<0.05). The dominated phylogenic groups in intertidal mudflat of YRE includedProteobacteria, Acidobacteria and some unidentified bacteria.

Key words:Yellow River Estuary; intertidal mudflat; bacterial community; bacterial diversity

中圖法分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)01-108-08

作者簡介：王凱(1989-)，男，碩士。E-mail：wangkai@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-03-10；

修訂日期：2015-04-18

*基金項目：國家自然科學基金項目(41176064) 資助

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150076

引用格式：王凱， 鄒立， 高冬梅, 等. 黃河口潮灘春季細菌群落的分布特征及其影響因素研究[J]. 中國海洋大學(自然科學版)， 2016, 46(1)： 108-115.

WANG Kai , ZOU Li, GAO Dong-Mei, et al. Characteristics of bacterial community and associated environmental impacts in intertidal mudflat of Yellow River Estuary, China[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(1): 108-115.

Supported by the National NaturalScience Foundation of China(41176064)

**通訊作者： E-mail：zouli@ouc.edu.cn