誘導多能干細胞的制備及其應用進展

張愛珍，溫宗壯，姜文杰，宗文，高建剛，趙晶

(山東大學生命科學學院，濟南250100)

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誘導多能干細胞的制備及其應用進展

張愛珍，溫宗壯，姜文杰，宗文，高建剛，趙晶

(山東大學生命科學學院，濟南250100)

摘要：本文介紹了誘導多能干細胞(iPS)制備、來源，外周血誘導制備iPS的優(yōu)勢，iPS在人類疾病模型、再生醫(yī)學和藥物研發(fā)領(lǐng)域的應用，以及目前iPS研究存在的問題。認為iPS的產(chǎn)生是生命科學研究的重要成果，未來iPS技術(shù)的不斷完善對臨床多種疾病的治療有重要意義。

關(guān)鍵詞：誘導多能干細胞；胚胎干細胞；外周血細胞；疾病模型；再生醫(yī)學；藥物研發(fā)

全能干細胞是指一類具有潛在的分化成不同種類細胞(如肌細胞、神經(jīng)細胞甚至是生殖細胞)能力的細胞。胚胎干細胞(ES)是一類來源于囊胚期內(nèi)細胞團的全能性細胞，可以產(chǎn)生任意類型的細胞來滿足不同的應用需求。然而，由于細胞來源的倫理問題和細胞治療中免疫排斥反應，人類ES的研究和臨床應用受到限制。2006年，有研究者[1]通過過表達幾種轉(zhuǎn)錄因子得到了誘導多能性干細胞(iPS)。iPS沒有倫理上的爭論，具有跟ES相同的自我更新和多能性，故此項研究獲得2012年諾貝爾醫(yī)學生理學獎。本文就iPS的發(fā)展和其在藥理學和醫(yī)學上的應用綜述如下。

1iPS的制備及來源

2006年，有研究者[1]選取了24種ES中重要的轉(zhuǎn)錄因子基因作為重編程候選因子。這些候選因子的不同組合按順序?qū)胄∈笈咛コ衫w維細胞，通過Fbx15-Neo表達系統(tǒng)來篩選適當?shù)闹鼐幊桃蜃?。如果這些候選基因能夠重編程這些成纖維細胞，具有G418抗性的干細胞樣克隆大約在2周后出現(xiàn)。最后，這24個候選因子縮小到4個轉(zhuǎn)錄因子。導入Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc后，小鼠胚胎成纖維細胞被重編程為具有ES特征的細胞，這些細胞稱為iPS[2]。2007年，Takahashi和Yu分別將人類體細胞重編程為iPS。 前者使用了Oct3/4、Sox2、Klf4以及c-Myc 四種因子[3]，而后者則使用了Oct3/4、Sox2,、Nanog和Lin28四種因子[4]。兩項研究均表明人類iPS與ES在形態(tài)、增殖、多能性標記物、基因表達譜、表觀遺傳和分化潛能等很多方面相似。這些發(fā)現(xiàn)顯示人類iPS可以用來替代ES。

目前，iPS可以從多種動物如小鼠、大鼠、猿、獼猴、豬、兔以及人類中誘導得到。然而，大多數(shù)的iPS不能得到活的嵌合體。鑒于成纖維細胞的成功，很多其他種類的細胞也被研究是否具有重編程的可能性。已經(jīng)成功的細胞類型有肝細胞、胃上皮細胞、角質(zhì)細胞、胃細胞、間充質(zhì)細胞、神經(jīng)干細胞、胰腺細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、造血祖細胞、臍帶血細胞、外周血細胞等。

2 外周血誘導制備iPS的優(yōu)勢

由于成纖維細胞的易誘導性和較高的誘導效率，人類iPS通常是用成纖維細胞誘導的。要獲得成纖維細胞首先要切下皮膚組織，再進行一段時間的細胞培養(yǎng)，在此過程中，患者需要承受疼痛和承擔被感染的風險，從而限制了iPS的廣泛應用。血細胞是用來重編程誘導最容易得到的患者組織細胞來源，因為在誘導之前，不需要培養(yǎng)一段時間，靜脈取血比取皮膚組織安全；而且大量的外周血樣本可以被凍存在血庫中，直接用來得到iPS。

小鼠外周血細胞的重編程開始于2008年。Hanna等[5]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染Oct3/4、Klf4、Sox2和 c-Myc重編程小鼠B淋巴細胞。他們通過體外表達轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/結(jié)合蛋白α增強子，或敲低B細胞轉(zhuǎn)錄因子Pax5來提高重編程效率。Hong等[6]在p53缺失的條件下，將Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc導入小鼠T淋巴細胞獲得iPS。繼小鼠外周血誘導成功，Haase從人臍帶血中誘導得到iPS[7]。臍帶血可以直接從臍帶血庫中獲得，且對捐贈者沒有風險。Ye等[8]從健康的凍存臍帶血細胞和 CD34+細胞中誘導得到iPS。但是，使用臍帶血仍然有限制，因為只能從嬰兒得到臍帶血。

2010年，有3個研究團隊分別從人的外周血細胞得到了iPS[9～11]。Loh等[10]通過靜脈穿刺和聚蔗糖密度離心從外周血樣品中分離得到單核細胞(PBMC)和CD34+細胞。在感染能表達KLF4、SOX2、Oct3/4和c-Myc的慢病毒后，CD34+細胞表現(xiàn)出0.002%的重編程效率，而PBMC細胞顯示相對較低的重編程效率，為0.000 8%~0.001%。Staerk等[11]利用一個強力霉素誘導的慢病毒載體將T淋巴細胞和骨髓細胞重編程了iPS，這種慢病毒載體可編碼4種重編程因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)。他們的研究結(jié)果表明，T淋巴細胞的重編程效率比骨髓細胞更高。這是因為T淋巴細胞比骨髓細胞表現(xiàn)出更高的增殖率并且在體外可以生長更長時間。Seki等[9]利用一種編碼Oct3/4、SOX2、Klf4和c-Myc基因的SeV溫度敏感突變載體將T淋巴細胞誘導成iPS，重編程效率達到0.1%。SeV載體是一個非整合型載體，不能在標準培養(yǎng)溫度下增殖。這些特性顯著增加了iPS產(chǎn)生的安全性。Chou等[12]利用改進的EBNA1/OriP質(zhì)粒將新生兒的臍帶血和成人PBMC重編程為iPS。通過這個新的重新編程載體，由外周血誘導的iPS可在14 d內(nèi)得到，而先前成纖維細胞誘導得到iPS需要28～30 d。

研究發(fā)現(xiàn)，從外周血細胞獲得的人iPS在形態(tài)學、表面抗原、多能性基因表達、DNA甲基化和分化潛能方面可以與人ES相似，PBMC來源的iPS可靠、安全。因此，從人外周血細胞獲得iPS方法的成功將加快推廣iPS在未來的臨床應用。Lei等[13]將人iPS分化成常規(guī)的T淋巴細胞和具有抗原特異性的T淋巴細胞，用于以T細胞為基礎(chǔ)的體外或體內(nèi)免疫治療。最近Ebihara等[14]研究表明，人iPS可以通過再分化獲得大量的血細胞。因為這些細胞在體外可以無限增殖而且避免了由輸血而引起的疾病傳染，未來可以作為臨床輸血的重要來源。

3 iPS的應用

與ES相同的是小鼠iPS也可以分化成任何類型的細胞，包括生殖系細胞[15]，這意味著人們可以得到大量的各種分化細胞用于研究和治療。Zhu等[16,17]研究了人和小鼠的iPS分化成精原干細胞和晚期雄性生殖細胞的潛能，并為揭示雄性生殖細胞發(fā)育的分子機制提供了模型。目前為止，iPS主要被應用于人類疾病模型、再生醫(yī)學和藥物研發(fā)三個領(lǐng)域。

3.1疾病模型人類遺傳疾病治療研究的主要問題是實驗材料的來源，iPS可以通過建立特定的疾病模型來解決這些問題。通過利用患者特異性iPS已經(jīng)建立了多種人類疾病模型，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌肉萎縮、帕金森病、蕾特癥、地中海貧血、腺苷脫氨酶缺乏癥有關(guān)嚴重聯(lián)合免疫缺陷、戈謝病、杜氏肌營養(yǎng)不良、貝殼肌營養(yǎng)不良癥、亨廷頓疾病、1型糖尿病、唐氏綜合征、萊施-奈恩綜合征(攜帶者)。由iPS制作的疾病模型有助于探索疾病的發(fā)病機制，利用iPS進行特異性治療是其整個應用領(lǐng)域最有價值的成果，由iPS產(chǎn)生各類細胞為治療體內(nèi)多種組織系統(tǒng)的疾病提供了可能。

3.2再生醫(yī)學免疫排斥是器官移植和細胞治療過程中存在的一個重大問題，因為長期使用免疫抑制藥物治療會產(chǎn)生一系列不良反應?；颊咛禺愋缘膇PS具有免疫標記，也就不存在免疫排斥。除此之外，通過在患者特異性的iPS中進行基因打靶可以修復由疾病引起的突變。修復的細胞可以分化成靶細胞，然后將靶細胞移植到發(fā)病區(qū)域，就可以減輕疾病癥狀。Hanna等[5]利用小鼠模型證明iPS可以治療鐮刀狀細胞貧血病，這是一種遺傳性血液疾病，使紅細胞無法正常工作。通過對小鼠模型的iPS進行基因打靶可以修復由疾病引起的突變，修復的iPS可以分化成造血干細胞。這些健康的造血干細胞被移植到貧血小鼠中，然后進行增殖并產(chǎn)生正常的紅細胞，這樣就可以治療該疾病。目前，影響以上個性化醫(yī)療實施可能性的一些限制因素仍然存在，包括iPS的安全性和重編程效率以及選擇最適合重編程的細胞類型等。

3.3藥物研發(fā)在藥物研發(fā)的過程中，研究者會對藥物的治療效果和不良反應進行測試，使用的測試動物通常是小鼠、狗和豬。但是，這些測試費用昂貴，且人和動物存在差異。此外，動物試驗也不能做到有效標準化?，F(xiàn)在，我們可以利用疾病模型得到患者特異性iPS對新藥物進行有效測試。有些治療藥物已經(jīng)在多種疾病患者來源的特異性iPS中通過了測試，如脊髓性肌萎縮、家族性自主神經(jīng)功能異常和LEOPARD綜合征[18]。研究證實，該新型藥物對患者特異性iPS能起作用，表明了它們具有良好的治療潛力。

4iPS存在的問題

目前， iPS在臨床應用上仍存在一些問題需要解決。例如在人iPS中觀察到許多基因變化，包括染色體非整倍體、易位、點突變、堿基大規(guī)模重復和缺失等，這些問題可能會限制iPS在人類疾病治療中的應用。Gore等[19]對7個實驗室的22個人iPS細胞系的基因組進行外顯子測序，他們在這些iPS細胞系中發(fā)現(xiàn)了124個親本細胞中沒有的點突變，這些突變很多涉及到蛋白質(zhì)功能修復以及癌癥相關(guān)基因。雖然重編程手段可能導致基因組異常，但是這并不代表所有的異常都是由它導致的，因為通過不同方法獲得的人iPS都存在基因組的異常，包括更安全地使用合成mRNAs進行非嵌入式轉(zhuǎn)染[20]。盡管重編程效率低是阻礙該領(lǐng)域研究前進的主要障礙，但是與重編效率提高相比，解決iPS中染色體異?？赡芨匾?。因此，在未來獲得較少基因組突變的iPS將是該領(lǐng)域的研究焦點。同樣，在體細胞重編程時引起的染色體異常也急需解決。此外，還存在有關(guān) iPS的誘導機制、最佳重編程因子、如何減少iPS基因突變的風險、如何實現(xiàn)定向分化、如何在臨床上評估iPS的安全指數(shù)等問題。

iPS的產(chǎn)生被認為是生命科學的一個重大事件，并且正在迅速地走向臨床應用。最新研究表明，從外周血來源的iPS及其化學重新編程策略將極大地提升其治療潛力。隨著iPS技術(shù)的改善，iPS的臨床治療未來已經(jīng)可以預見。

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(收稿日期：2015-11-01)

中圖分類號：R394.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0099-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.042