針刺單穴及腧穴配伍對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Cajal間質細胞影響

李亞勤于 波李 鐵趙宗江楊美娟王富春

（1長春中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，長春，130117；2北京中醫(yī)藥大學，北京，100029）

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針刺單穴及腧穴配伍對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇Cajal間質細胞影響

李亞勤1于 波1李 鐵1趙宗江2楊美娟2王富春1

（1長春中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，長春，130117；2北京中醫(yī)藥大學，北京，100029）

摘要目的：探討針刺單穴及腧穴配伍對糖尿病胃輕癱（Diabetic gastroparesis，DGP）大鼠胃竇Cajal間質細胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）的影響。方法：選取雄性SD大鼠50只，隨機分為正常組、模型組、多潘立酮組、足三里組、中脘＋足三里組，每組10只。以鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射誘導DGP大鼠模型。采用免疫組化技術觀察各組大鼠ICC含量的改變。結果：與正常組相比，模型組大鼠胃竇組織ICC含量明顯減少（P＜0. 01）；與模型組比較，多潘立酮組（P＜0. 01）、足三里組（P＜0. 05）、中脘＋足三里組（P＜0. 01）大鼠胃竇ICC含量明顯提高，且中脘＋足三里組優(yōu)于足三里組（P＜0. 05）。結論：針刺促進DGP大鼠胃竇ICC含量恢復，腧穴配伍組優(yōu)于單穴組。

關鍵詞糖尿病胃輕癱；針刺；腧穴配伍；Cajal間質細胞

Effect of Acupuncture at Slngle Acupolnt and Comblned Acupolnts on Antral Interstltlal Cells of Cajal ln Dlabetlc Gastroparesls Model Rats

Li Yaqin1，Yu Bo1，Li Tie1，Zhao Zongjiang2，Yang Meijuan2，Wang Fuchun1
（1 College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina of Changchun University of TCM，Changchun 130117，China；2 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objectlve：To explore the effects of acupuncture at single acupoint and combined acupoints on antral interstitial cells of Cajal（ICC）in diabetic gastroparesis model rats. Methods：50 SD male rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats in each，namely normal group，diabetic gastroparesis model rats group（the model group），domperidone group，acupuncture at ST36 group and acupuncture at ST36＋CV12 group. The rats were intraperitoneally injected with steptozotocin to set diabetic gastroparesis model. Treatments for each group lasted for 5 weeks. Numbers of ICC were detected by immunohistochemical methods. Results：The number of ICC in the model group were significantly reduced（P＜0. 01），compared with normal group，while numbers of ICC in domperidone group（P＜0. 01），acupuncture at ST36 group（P＜0. 05）and ST36＋CV12 group（P＜0. 01）were improved significantly，compared with the model group. Numbers of ICC in the acupuncture at ST36＋CV12 group was increased remarkably superior to the acupuncture at ST36 group（P＜0. 05）. Concluslon：Acupuncture could improve the numbers of antral interstitial cells of Cajal in diabetic gastroparesis model rats，and acupuncture at combined acupoints was better than that of the single acupoint.

Key Words Diabetic gastroparesis；Acupuncture；Acupoint combination；Interstitial cells of Cajal

糖尿病胃輕癱（Diabetic gastroparesis，DGP）是以胃動力低下為主要特點的糖尿病繼發(fā)癥狀之一，病理生理特點主要是胃電節(jié)律異常、胃腸轉運時間延長、排空延遲［1］，臨床表現(xiàn)為惡心、腹脹、厭食、早飽等［2］。廣泛的臨床研究證明［3-7］針刺對緩解DGP癥狀有良好的效果，具有療效持久、不良反應小等優(yōu)勢，然而，針刺治療DGP選穴優(yōu)化研究卻少見，因此，本實驗以鏈脲佐菌素（STZ）誘導DGP模型［8］，觀察針刺單穴及腧穴配伍對DGP大鼠胃竇Cajal間質細胞含量影響的效應差異，并對其機制進行探討。

1　材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠50只，體重180～200 g（購自斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，許可證編號：SCXK（京）2011-0004）。

1. 1. 2 試劑與儀器 針灸針（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品，批號：140020）；電子診療儀（SDZ-II型，華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品，產(chǎn)品標準號：YZB／蘇0691-2013）；多潘立酮片（10 mg／片，哈藥集團三精制藥諾捷有限責任公司產(chǎn)品，批號：1312024）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma，批號：S0130）；c-kit（sc-168，SANTA CRUZ，批號：B0813）；GFVisionTM III抗鼠／兔通用型免疫組化檢測試劑盒（基因科技（上海）有限公司，批號：GK500705）。

1. 2 方法

1. 2. 1 分組與造模 將50只大鼠置于潔凈通風櫥中，室溫（23±2）℃，相對濕度60%，自然光照條件，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)10 d禁食12 h后，按體質量區(qū)段隨機取10只大鼠作為正常組，余40只大鼠以鏈脲佐菌素（50 mg／kg）腹腔注射，以血糖≥16. 7 mmol／L者為糖尿病大鼠，常規(guī)喂養(yǎng)8周后為DGP大鼠造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、多潘立酮組、足三里組、中脘＋足三里組，每組10只。

1. 2. 2 治療方法 各治療組大鼠分別予以如下操作：針刺組：將大鼠置于自制鼠套中固定，分別取足三里（雙側）、中脘＋足三里（雙側），取穴參照《實驗針灸學》《大鼠穴位圖譜的研制》提供的腧穴位置，采用比較解剖學確定大鼠腧穴。使用0. 25 mm×40 mm針灸針，刺入5～7 mm，連接電針，參數(shù)選為連續(xù)波，頻率為30 Hz，強度為3 mA，刺激時間為15 min，1次／d，5 d為1個療程，每療程間隔2 d，共5個療程。多潘立酮組：參照動物劑量換算公式確定灌胃劑量，處理時間同針刺組。療程結束后觀察指標。

1. 2. 3 觀察指標及檢測方法

1. 2. 3. 1 一般狀態(tài) 觀察大鼠的精神狀態(tài)，包括體質量、飲食、皮毛及活動情況等。

1. 2. 3. 2 胃組織HE染色和免疫組化 無菌摘取胃臟，取胃竇部分常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，4℃保存。HE染色方法：切片常規(guī)脫蠟，自來水沖洗，蘇木精液染色7 min，自來水沖洗后1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒，自來水稍洗后0. 5%伊紅液染色3 min，蒸餾水稍洗后常規(guī)脫水，中性樹膠封片。C-kit陽性ICC免疫組化染色方法：切片于室溫放置30 min后，常規(guī)脫蠟，0. 01 mmol／lPBS漂洗5 min×3次，0. 01%Triton溶液37℃孵育15 min，PBS漂洗5 min×3次，3% H2O2-CH3OH室溫下避光孵育10 min，PBS漂洗5 min×3次，抗原修復液中加熱15 min，以不沸騰為度，冷卻1 h后PBS漂洗5 min×3次，20%蛋清稀釋液37℃孵育20 min，PBS漂洗5 min×1次，10%山羊血清封閉，37℃孵育20 min后輕輕甩去，滴加一抗c-kit（1∶300）4℃過夜。滴加HRP標記復合物（抗兔／鼠），37℃孵育25 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加顯色劑DAB工作液，室溫避光孵育15 min，自來水沖洗10 min，蒸餾水3 min，蘇木素復染3 min后自來水沖洗15 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。

1. 3 圖像分析統(tǒng)計 免疫組化結果用NIS-ElementsBR3. 1圖像分析軟件進行圖像分析，各組圖像分析數(shù)據(jù)采用（±s）表示，應用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0. 05差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2. 1 一般狀態(tài) 模型組大鼠精神萎靡、毛發(fā)干枯、活動遲緩、飲食減退、體型消瘦及尿量減少，第9周時出現(xiàn)潰瘍、白內障等多種糖尿病并發(fā)癥，治療組以上情況均有不同程度的改善，尤中脘＋足三里組明顯。

2. 2 DGP大鼠胃竇病理形態(tài) HE染色結果如圖1；免疫組化c-kit陽性ICC染色結果：正常組大鼠胃竇組織有大量棕黃色顆粒，主要分布在環(huán)肌與縱肌層之間肌間神經(jīng)叢周圍，并圍繞神經(jīng)節(jié)細胞形成類似“鞘樣”結構；模型組大鼠胃竇肌間少量棕黃色顆粒，染色淺；多潘立酮組大鼠胃竇肌間中等量棕黃色顆粒，染色淺；足三里組鼠胃竇肌間中等量棕黃色顆粒，染色淺；中脘＋足三里組鼠胃竇肌間大量棕黃色顆粒，染色深。與模型組比較，多潘立酮組、中脘＋足三里組（P＜0. 01）、足三里組（P＜0. 05）表達明顯增多，有統(tǒng)計學意義，見表1、圖2。

3　討論

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活方式的大幅改變以及人口老齡化，糖尿病的發(fā)病率日益升高，DGP作為糖尿病的常見并發(fā)癥，其發(fā)生率亦有增加趨勢，嚴重威脅國民身心健康。DGP多見于糖尿病病情控制欠佳、病程長、胰島素依賴性患者，其發(fā)生機理較為復雜，現(xiàn)代醫(yī)學認為與高血糖、自主神經(jīng)功能紊亂、胃腸道激素分泌失常、肌間神經(jīng)叢型一氧化氮合酶表達缺失、ICC網(wǎng)絡功能紊亂、氧化應激等有關［9-11］。其中，ICC網(wǎng)絡破壞是胃腸動力學領域的研究熱點，在DGP發(fā)病中其關鍵性作用［12］。

ICC是分布于胃腸道神經(jīng)末梢及平滑肌之間的一種特殊間質細胞［13］，ICC以網(wǎng)絡狀分布在胃腸道，一般將它們分為4類：1）黏膜下ICC（ICC-SM），位于黏膜與環(huán)形肌之間；2）肌間ICC（ICC-MY），位于環(huán)形肌和縱行肌之間；3）肌內ICC（ICC-IM）散布在平滑肌細胞之間；4）深層肌叢（ICC-DMP），在小腸，ICC-IM濃集在環(huán)形肌深部肌叢內，稱為ICC-DMP。

表1　各組大鼠胃竇肌間c-kit陽性ICC含量（面積／μm2）

圖1　胃竇HE染色（×400）

圖2　胃竇c-kit陽性ICC表現(xiàn)（×400）

在胃腸道的不同部位，ICC的分布也有所差異。胃底僅有IC-IM，而胃體、胃竇分布有IC-IM、ICMY［14］。ICC與腸神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌共同組成復雜的胃腸運動控制系統(tǒng)［15］。ICC是胃腸道平滑肌慢波電位的起搏者和傳導者［16］，慢波是胃腸道的基本電節(jié)律，調控著胃腸運動發(fā)生的時間、地點、頻率和方向。起搏電位產(chǎn)生于有ICC-MY的Auerbach's神經(jīng)節(jié)區(qū)域，ICC-MY能自發(fā)地產(chǎn)生小波幅的短暫的去極化電位，即單元電位（unitary potenti-al）［17］，是Ca2＋從內源性Ca2＋庫釋放，激活Ca2＋活化的Cl通道所致［18］。起博電位的產(chǎn)生是單元電位釋放頻率變化的結果［19］。在胃ICC-MY，兩次起博間期，單元電位的釋放頻率逐步加快，多個單元電位在局部總和產(chǎn)生初始部分。初始部分使ICC-MY網(wǎng)絡去極化，進一步加快單元電位的釋放頻率，產(chǎn)生起博電位的平臺部分，ICC產(chǎn)生的起搏電位經(jīng)平滑肌細胞補充后形成完整的慢波。ICC不僅引起平滑肌的自發(fā)節(jié)律性收縮，還提供了電活動的傳播途徑，以保證慢波協(xié)調性播散［16，20］；除此之外，ICC對腸神經(jīng)信號的傳遞具有調節(jié)作用［20-21］，研究發(fā)現(xiàn)ICC與平滑肌纖維混合并存于肌間，ICC與腸神經(jīng)元亦緊密連接，ICC胞體和腸神經(jīng)元形成突觸樣連接，與平滑肌細胞形成似縫隙連接，提示ICC可能受腸神經(jīng)元支配、傳遞和調節(jié)各種神經(jīng)遞質，進而調控胃腸平滑肌收縮運動，ICC在腸神經(jīng)元和平滑肌細胞之間可能起橋梁作用［22］。因此，ICC的缺失或處于病生理條件時可出現(xiàn)胃腸道平滑肌反射能力減弱的現(xiàn)象［23］，糖尿病小鼠胃體、胃竇內ICC明顯減少，以胃竇遠端最明顯，不僅如此，胃腸動力障礙性疾病，例如慢傳輸性便秘、Hirschsprung病、慢性假性腸梗阻，甚至炎癥性腸病等也伴隨ICC數(shù)目減少、形態(tài)和超微結構的改變［24-27］，胃腸動力的恢復亦伴隨ICC增殖［28］。

ICC的基因表達產(chǎn)物C-kit的發(fā)現(xiàn)或許是間質細胞生理學方面最重要的進展［29］。Kit受體的標記物或C-kit mRNA已經(jīng)成為在不同物種的腸道內研究ICC的有效工具。C-kit抗體在消化道僅標記ICC和肥大細胞，具有較高的特異性，后者形圓，甲苯胺藍染色時因異染呈紅紫色，可與之鑒別，但數(shù)目較少，僅占4%，大部分可以忽略不計。ICC特異性表達C-kit免疫組織化學法可以觀察胃腸道ICC的分布與密度，對于深入研究ICC具有極為重要的意義。

DGP患者胃排空時間大于正常人2個平均標準差，嚴重影響患者的生活質量及血糖控制［30-33］，目前常規(guī)療法為服用促動力藥物，如多潘立酮、西沙必利、莫沙必利、胃復安等，以及胃電刺激、手術等，存在耐藥性、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)副作用、感染風險、營養(yǎng)不良等問題［34］。針灸針對該疾病雖屬一種替代療法，但因其安全性、經(jīng)濟性等優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛的應用［35］。中醫(yī)文獻中無DGP的病名，多根據(jù)其主要臨床癥狀歸入“嘔吐”“痞滿”“反胃”“嘈雜”等范疇［36］，病位主要在胃，涉及肝脾，屬虛實夾雜之證。臨床研究證明，針灸能夠改善糖尿病胃輕癱患者的胃排空功能，緩解腹部癥狀，增強食欲，并且鮮有不良反應的報道［37］。實驗研究顯示，電針可改善胃輕癱大鼠Cajal間質細胞的超微結構，減輕線粒體損傷，促進ICC和膽堿能神經(jīng)再生，網(wǎng)絡結構的恢復［38-39］，并可使胃電主頻和主功率、ICC表達含量升高，從而改變已經(jīng)紊亂的胃電節(jié)律，達到改善胃腸動力的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，針刺治療DGP以足三里穴運用頻率最高，其次為中脘穴，刺激足三里、中脘能有效地降低胃張力，解除賁門、幽門的遲緩關閉，使胃動力障礙患者的胃電圖不規(guī)則波減少，使胃電節(jié)律趨于正常［40］?！鹅`樞·邪氣藏府病形》認為“合治內府”，胃的合穴是足三里，中脘為胃腑之氣聚積之處，內通于胃腑之氣，與胃腑有著密切的橫向聯(lián)系，故可用于治療脾胃疾患，如胃脘痛，胃脹，嘔吐，反胃，吞酸，納呆，食不化等。導師王富春教授在國內首次提出“合募配穴治療六腑病”的理論［41］，以及的“同功穴”新概念［42］，即為針對某一癥狀，具有相同主治作用的一類腧穴，對腧穴配伍的協(xié)同增效作用進行了進一步詮釋。

目前，針刺對于DGP的研究尚處于證明其有效性階段，鮮有針刺選穴對DGP影響效應差異的對比研究。本實驗取足三里組與中脘＋足三里組進行比較，以觀察單穴與腧穴配伍對于DGP大鼠胃竇Cajal影響。研究發(fā)現(xiàn)，針刺治療組可改善DGP大鼠一般情況，改善大鼠飲食減退、體型消瘦及尿量減少等情況，尤中脘＋足三里組明顯；中脘＋足三里組較足三里組c-kit免疫組化染色陽性面積增加，陽性染色強度明顯增強，減輕了DGP大鼠胃竇ICC的病理損害，延緩了DGP的病程進展，說明腧穴配伍組對于DGP的針刺效果優(yōu)于單穴組，進而說明“合募配穴”發(fā)揮了協(xié)同增效作用。提示針刺單穴及腧穴配伍對DGP大鼠作用效應差異可能是通過Cajal間質細胞的數(shù)目，影響胃慢波的產(chǎn)生，使胃電節(jié)律紊亂減輕從而產(chǎn)生正常蠕動，并促進腸神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌間的信息傳遞，從而促進平滑肌收縮能力的恢復而實現(xiàn)的，這為針刺防治DGP，為腧穴配伍理論進一步發(fā)展提供了現(xiàn)代分子生物學實驗依據(jù)。

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（2016－01－12收稿 責任編輯：洪志強）

中圖分類號：R224. 2

文獻標識碼：A dol：10. 3969／j. issn. 1673－7202. 2016. 02. 007

通信作者：王富春（1961—），男，教授，博士研究生導師，研究方向：特定穴理論與臨床研究，E-mail：fuchenwang420＠126. com

作者簡介：李亞勤（1990—），女，長春中醫(yī)藥大學2013級碩士研究生，研究方向：特定穴理論與臨床研究，E-mail：liyaqin19902008＠126. com

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（編號：2014CB543100）；吉林省衛(wèi)生廳項目（編號：2014Q048）