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    酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)檢驗方法的建立

    2016-04-06 03:34:50孫麗美張現(xiàn)峰張兆峰劉龍?zhí)?/span>
    獸醫(yī)導刊 2016年2期
    關(guān)鍵詞:泰樂液相色譜儀酒石酸

    孫麗美 張現(xiàn)峰 張兆峰 劉龍?zhí)?/p>

    (山東魯抗生物制造有限公司,山東濟寧 273517)

    酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)檢驗方法的建立

    孫麗美 張現(xiàn)峰 張兆峰 劉龍?zhí)?/p>

    (山東魯抗生物制造有限公司,山東濟寧 273517)

    酒石酸泰樂菌素是我國目前常用的一種獸用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1],亦稱泰農(nóng)、泰樂霉素,可由放線菌屬弗氏鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵提取而得到,有泰樂菌素堿、磷酸鹽和酒石酸鹽3種形態(tài)。本文建立的酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)的檢驗方法適用于酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)的限度檢測[9]。分析驗證表明該方法準確、可靠,重復性好,可用于控制酒石酸泰樂菌素中殘留蛋白質(zhì)的檢測。

    酒石酸泰樂菌素;檢驗方法;分析

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    高效液相色譜儀(Ultimate3000,賽默飛世爾(戴安)中國有限公司);電子天平

    1.2 化學試劑

    磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司提供,分析純),磷酸氫二鈉(天津市凱通化學試劑有限公司提供,分析純),氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司提供,分析純),BSA(上海伯奧生物科技有限公司提供,生化試劑)。乙腈,甲醇均為色譜純,由天津市凱通化學試劑有限公司提供。

    1.3 酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)檢測方法

    色譜柱:凝膠排阻柱(TSKgel G2000SWXL,5μm,7.8 mm ID×30 cm,Column No. A00126);流速:1.0ml/min;檢測波長:215nm;柱溫:25℃;流動相:0.02M磷酸鹽緩沖液(稱取約0.59g磷酸二氫鈉、5.8g磷酸氫二鈉、9g氯化鈉用水溶解并稀釋至1000ml,混合均勻,用0.45μm的濾膜過濾),進樣量:10μl。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 系統(tǒng)適用性試驗

    取系統(tǒng)適用性標準品溶液10μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。結(jié)論:BSA峰與其他色譜峰分離度大于1.5,系統(tǒng)適用性試驗符合要求。

    2.2 專屬性

    分別取BSA溶液、供試品溶液及供試品溶液與BSA溶液的混合液(供試品溶液與BSA溶液以1:1的比例進行混合)進行專屬性試驗。結(jié)果表明,供試品溶液中無峰。結(jié)論:該方法的專屬性符合要求。

    2.3 線性

    取標準溶液逐級稀釋,得濃度不同的線性試驗用系列標準溶液。以標準溶液的濃度為橫坐標,以峰面積的平均值為縱坐標做標準曲線,得回歸方程y=50.226x-1.5755,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9997,結(jié)果表明殘留蛋白在20~140μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.4 檢測限和定量限

    取稀釋后的各溶液10μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。得泰樂菌素中殘留蛋白質(zhì)的檢測限(S/N=3)為2.5 μg/ml,定量限(S/N=10)為7.5μg/ml。

    2.5 準確度與精密度

    取供試品適量進行加標回收率試驗,系統(tǒng)考察方法的準確度。分別進行80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml添加濃度的回收率試驗,每批次同一濃度做3個平行,取上述準確度試驗用系列溶液各10μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖及BSA峰的峰面積。平均回收率(n=9)為96.6%,RSD為1.34%。

    2.6 供試品測定

    利用以上建立的方法分別取上述供試品溶液各10μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,并記錄供試品溶液中BSA的峰面積。

    3 討論與小結(jié)

    3.1 液相色譜柱的選擇

    在選定的流動相系統(tǒng)下,采用不同品牌的凝膠排阻柱色譜柱進行測定,均獲得良好的峰形與分離度,顯示本方法耐用性好,故選擇凝膠排阻柱色譜柱。

    3.2 溶劑的確定

    酒石酸泰樂菌素屬于獸用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,極性較弱,在流動相選擇上比較了磷酸鹽緩沖液/水,磷酸鹽緩沖液/乙腈以及水/乙腈的色譜保留性能和靈敏度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸鹽緩沖液/水流動相體系殘留蛋白峰型最好、靈敏度最高。進一步優(yōu)化磷酸溶液濃度和流動相配比,使殘留蛋白獲得最佳峰型和保留時間,最終確定流動相為0.02M磷酸鹽緩沖液/水,流速為1.0ml/min。

    3.3 進樣量的確定

    分別取系統(tǒng)適用性標準品溶液進樣25,20,15,10,5μl,結(jié)果主峰柱效分別為4984,5816,6017,15423,9187,故選擇進樣量為10μl。

    4 結(jié)論

    通過對建立的酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)的檢測方法的驗證,可知:該方法的系統(tǒng)適用性試驗中BSA峰的保留時間的RSD為:0.1%;峰面積的RSD為:1.0%;BSA峰與酒石酸泰樂菌素的相應的峰的分離度為:8.3。系統(tǒng)適用性試驗符合方法驗證的要求。該方法對酒石酸泰樂菌素中的蛋白質(zhì)的測定專屬性良好,泰樂菌素自身獲得的色譜峰對蛋白質(zhì)的色譜峰沒有影響。該方法的檢測限為:2.5 μg/ml。

    本研究探討并建立了利用高效液相色譜法測定酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)的檢驗方法。結(jié)果表明該方法準確、可靠,重復性好,可適用于酒石酸泰樂菌素殘留蛋白質(zhì)的限度檢測。

    [1]張致平.微生物藥物學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003.

    [2]侯玉榮,袁耀佐,張玫,等.β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的研究和檢測方法進展[J].藥學與臨床研究,2012,20(3):240-244.

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