p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

黃平，張雪，陳光元，金瑛

(深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦科，廣東深圳518105)

p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

黃平，張雪，陳光元，金瑛

(深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦科，廣東深圳518105)

目的觀察p16基因、Ki67蛋白、核分裂特異性抗體(PHH3)及人乳頭瘤病毒L1型(HPV-L1)基因在宮頸病變脫落細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律，并探討其臨床意義。方法選取2015年4月至2016年4月期間本院婦科收治的100例婦科病患者作為研究對象，取宮頸脫落細(xì)胞，行雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測和液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，檢測并分析HPV-L1、PHH3、Ki67、p16的表達(dá)水平。結(jié)果宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢出未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變(NILM)8例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞/低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASCUS/LSIL)42例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞不能排除高級別鱗狀上皮內(nèi)病變/高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H/HSIL)41例，鱗狀細(xì)胞癌(SCC)9例。ASCUS/LSIL患者的Ki67、PHH3、p16陽性檢出率分別為19.05%、4.76%、26.19%，均明顯低于ASC-H/HSIL患者的85.37%、88.89%、88.89%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；p16陽性表達(dá)對宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32% (56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分別為83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分別為70.97%(44/62)、100.00%(38/38)；ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽性表達(dá)率為69.05%，明顯高于ASC-H/HSIL(0)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論PHH3、Ki67、p16聯(lián)合檢測可作為篩查宮頸脫落細(xì)胞的輔助手段，其能夠有效提高宮頸癌及癌前病變的診斷準(zhǔn)確性，檢測HPV-L1能夠?qū)SCUS/SLIL病變程度進(jìn)行有效分流，為臨床治療提供一定的指導(dǎo)。

宮頸脫落細(xì)胞；核分裂特異性抗體；人乳頭瘤病毒；宮頸癌

宮頸癌是臨床發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤疾病，中國每年的宮頸癌新增病例數(shù)約占全球新增病例的29%，每年因?qū)m頸癌死亡的女性超過8萬，嚴(yán)重危害著我國女性的生理健康及生命安全[1]。做好宮頸癌及癌前病變篩查，對于改善患者預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。近期不少文獻(xiàn)研究都顯示，人乳頭瘤病毒L1(HPV-L1)蛋白、腫瘤增殖抗原(Ki67)和抑癌基因(p16)、核分裂特異性抗體(PHH3)均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系[2-3]。本研究旨在明確HPV-L1、Ki67、p16、PHH3表達(dá)在宮頸病變篩查中的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院婦產(chǎn)科2015年4月至2016年4月期間收治的100例行宮頸脫落細(xì)胞液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查和雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡21～63歲，平均(36.8±4.6)歲；近12個月內(nèi)未使用過激素藥物，未接受過宮頸治療；完成細(xì)胞學(xué)和HPV HC-Ⅱ檢測后行陰道鏡及宮頸活檢。

1.2 檢測方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)及HPV HC-Ⅱ檢測(1)細(xì)胞學(xué)檢查：將宮頸刷插入患者陰道，在宮頸鱗柱交界順時針旋轉(zhuǎn)5圈后取出，將取得的宮頸脫落細(xì)胞放在保存液中。將取得的宮頸脫落細(xì)胞制作成液基薄層涂片，由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師閱片，根據(jù)TBS分類法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分級。(2)HPV HC-Ⅱ檢測：使用采樣刷在患者宮頸口順時針旋轉(zhuǎn)4圈后取出，將采集到的宮頸分泌物放入保存液中，送檢。采用HC-Ⅱ法進(jìn)行HR-HPV DNA檢測，檢測的DNA型別包括68、59、58、56、52、51、45、39、35、33、31、18、16。其中任意一種類型的HR-HPV DNA結(jié)果為陽性，即判定為HR-HPV DNA陽性。

1.2.2 陰道鏡檢查和病理活檢陰道鏡檢查儀器使用顯微定影式光電一體陰道鏡，檢查過程中注意查看陰道壁情況，對異常部位進(jìn)行攝片。對陰道壁進(jìn)行碘染色，在不著色區(qū)取宮頸組織2～4塊，對于檢查未見異常者，分別在宮頸的3點、6點、9點、12點方向取宮頸組織，將取得的宮頸組織送病理科進(jìn)行病理活檢。對宮頸組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色、閱片。

1.2.3 宮頸脫落細(xì)胞免疫組化檢查將取得的宮頸脫落細(xì)胞液體標(biāo)本離心后石蠟包埋、切片，采用Envision二步法進(jìn)行PHH3、Ki67、p16表達(dá)檢測。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，病理檢查為宮頸癌的標(biāo)本為陽性對照。PHH3、Ki67、p16陽性表達(dá)均位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈棕色顆粒染色判定為陽性，無著色判定為陰性。

1.2.4 HPV-L1檢測HPV-L1試劑盒由美國愛迪旺斯公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒上的說明書進(jìn)行操作。HPV-L1陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈紅色染色判定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷與宮頸組織學(xué)診斷宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢出未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變(NILM)8例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞/低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASCUS/LSIL)42例，鱗狀上皮內(nèi)病變/高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H/HSIL)41例，SCC 9例，見表1。

表1 宮頸組織學(xué)與脫落細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果(例)

2.2 細(xì)胞學(xué)檢查與免疫標(biāo)記物表達(dá)ASCUS/ LSIL患者的Ki67、PHH3、p16陽性檢出率均顯著低于ASC-H/HSIL患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.547、32.068、30.123，P均＜0.05)；ASC-H/HSIL與SCC患者的Ki67、PHH3、p16陽性檢出率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.008，0.009及0.112，P＞0.05)，見表2。

表2 細(xì)胞學(xué)檢查與免疫標(biāo)記物表達(dá)比較[例(%)]

2.3 宮頸組織學(xué)診斷與免疫標(biāo)記物表達(dá)p16陽性表達(dá)對宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32%(56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分別為83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分別為70.97% (44/62)、100.00%(38/38)，見表3。

表3 免疫標(biāo)記物表達(dá)與宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果比較(例)

2.4 細(xì)胞學(xué)檢查與HPV-L1表達(dá)宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的92例患者，HPV-DNA檢測結(jié)果均呈陽性。其中ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽性表達(dá)率為69.05%(29/42)，ASC-H/HSIL患者的HPV-L1陽性表達(dá)率為19.51%(8/41)，SCC患者的HPV-L1陽性表達(dá)率為0。ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽性表達(dá)率明顯高于ASC-H/HSIL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 20.606，P＜0.05)。

3 討論

雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查是進(jìn)行宮頸病變篩查的常用手段，但因液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查的主觀性質(zhì)明顯，檢測結(jié)果多存在誤差。此外，HPV HC-Ⅱ檢測無法顯示病毒在細(xì)胞中存在的狀態(tài)，所以臨床還需尋找一些特異度和敏感度更高的標(biāo)志物，以提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確性[4]。

目前，已有研究證實宮頸癌的發(fā)生主要由HPV感染所致，HPV經(jīng)過長期的進(jìn)化發(fā)展，現(xiàn)已形成了多種類型，按照致病性、功能及結(jié)構(gòu)的不同可將其分為高危型HPV和低危型HPV兩大類[5]，而宮頸癌及癌前病變的發(fā)生是由高危型HPV持續(xù)感染引起的。HPV-L1蛋白是包裹在HPV DNA球心外層的主要衣殼蛋白，其作用為防止DNA受到核酸酶的破壞，保護(hù)病毒的致病活性。HPV-L1蛋白能夠識別并侵襲宿主細(xì)胞的特定部位，HPV附著在宿主細(xì)胞上以后，HPV-L1蛋白會協(xié)助病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部[6]。在HPV復(fù)制早期，HPV-L1呈陽性表達(dá)，而在病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合以后HPV-L1則呈陰性表達(dá)，所以檢測HPV-L1表達(dá)有助于判定HPV感染階段。本次研究結(jié)果顯示ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽性表達(dá)率明顯高于ASC-H/HSIL(P＜0.05)。這一結(jié)果與洪玉鋒等[7]的文獻(xiàn)報道結(jié)果相符，說明HPV-L1陽性表達(dá)可以作為HPV感染患者良惡性病變的鑒別手段，其能為臨床判定患者預(yù)后及轉(zhuǎn)歸效果提供可靠依據(jù)。p16基因是直接參與細(xì)胞周期調(diào)控功能的抑癌基因，其能對細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。p16在反應(yīng)性宮頸病變或正常宮頸細(xì)胞中呈陰性或微量表達(dá)，但其表達(dá)會隨著宮頸病變程度的加重而升高，可為宮頸癌惡性程度的判定提供依據(jù)[8]。PHH3是一種組蛋白H3抗體，具有抗磷酸化特性，其在正常的宮頸細(xì)胞中并不表達(dá)，只在發(fā)生病變的宮頸上皮細(xì)胞中表達(dá)。同時其表達(dá)水平還會隨著病變程度的加重而升高，其可作為核分裂標(biāo)記物對細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析[9]。Ki67蛋白是只存在于細(xì)胞核內(nèi)的多克隆抗體，其與細(xì)胞有絲分裂有著密切聯(lián)系，G0期細(xì)胞無Ki67表達(dá)，只有G1、S、G2、M期細(xì)胞有Ki67表達(dá)，并且Ki67會在細(xì)胞有絲分裂后期降解，是臨床判定腫瘤細(xì)胞增殖活性的有效指標(biāo)[10]。本次研究結(jié)果顯示p16陽性表達(dá)對宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32%、86.84%，Ki67為83.87%、89.47%，PHH3分別為70.97%、100.00%。從研究結(jié)果可以看出Ki67、PHH3、p16對宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度均較高，其中PHH3對宮頸癌的診斷特異度最高，提示進(jìn)行PHH3檢測能夠有效避免診斷結(jié)果的假陰性現(xiàn)象，提高診斷陽性率。

綜上所述，PHH3、Ki67、p16對宮頸癌及癌前病變有較高的敏感性和特異性，三者聯(lián)合檢測可作為篩查宮頸脫落細(xì)胞有效的輔助手段，能夠提高宮頸癌及癌前病變的診斷準(zhǔn)確性，檢測HPV-L1能夠?qū)SCUS/SLIL病變程度進(jìn)行有效分流，為臨床治療提供一定的指導(dǎo)。

[1]錢敏,姚芳芳,尤志學(xué),等.宮頸脫落細(xì)胞中HPV L1殼蛋白的表達(dá)及臨床意義[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2013,14(1):30-33.

[2]冷若冰,唐良萏.HPV L1殼蛋白檢測聯(lián)合細(xì)胞學(xué)在宮頸病變篩查中的臨床應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(28):3506-3509, 3514.

[3]齊朝陽,陳艷,曾鴻,等.宮頸上皮內(nèi)腫瘤P16、P53、Ki67、P63的表達(dá)與HPV感染及其臨床意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(20): 3638-3640.

[4]李思琦,董穎,畢蕙,等.年輕婦女宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ～Ⅱ級組織中p16InK4a和Ki67的表達(dá)及意義[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2014,30(4): 263-265.

[5]朱連成,伊喜苓,林蓓,等.p53、Ki67和CA125表達(dá)在宮頸微偏腺癌與普通宮頸腺癌鑒別中的價值[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(16): 2368-2371.

[6]Kusy M,Obrzut B,Kluska J.Application of gene expression programming and neural networks to predict adverse events of radical hysterectomy in cervical cancer patients[J].Med Biol Eng Comput, 2013,51(12):1357-1365.

[7]洪玉鋒,張熊.Ezrin和p16基因在宮頸癌和宮頸柱狀上皮異位組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué),2015,26(21):3127-3130.

[8]Saengkrit N1,Sanitrum P,Woramongkolchai N,et al.The PEI-introduced CS shell/PMMA core nanoparticle for silencing the expression of E6/E7 oncogenes in human cervical cells[J].Carbohydr Polym, 2012,90(3):1323-1329.

[9]張榮榮,王紅,張萍,等.宮頸癌組織中Twist與E-cadherin蛋白的表達(dá)及其意義[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(8):1105-1107.

[10]張哲雄,徐承來,曹永濤,等.高危型人乳頭狀病毒和IL-17在宮頸病變患者宮頸脫落細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性和臨床意義[J].中國實驗診斷學(xué),2012,16(2):252-254.

Expression and clinical significance of p16,Ki67,PHH3 and HPV-L1 in exfoliated cervical cells.

HUANG Ping,ZHANG Xue,CHEN Guang-yuan,JIN Ying.Department of Gynecology,Songgang People's Hospital of Bao'an District of Shenzhen,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the expression of p16 gene and Ki67 protein,mitosis-specific antibody anti-phosphohistone-H3(PHH3)and human papilloma virus(HPV)L1 protein(HPV-L1)gene in exfoliated cervical epithelial cells for cervical lesions,and to explore its clinical significance.MethodsA total of 100 patients of gynecological disease in Department of Gynecology from April 2015 to April 2016 were selected as research subjects. The exfoliated cervical cells were collected for high-risk HPV DNA detection by Hybrid CaptureⅡ(HPV HC-Ⅱdetection)and liquid-based cytology(LBC).The expression levels of HPV-L1,PHH3 Ki67 p16 were detected and analyzed.ResultsThere were negative for intraepithelial lesion or malignancy(NILM)in 8 cases,atypical squamous cells/low-grade squamous intraepithelial lesions(ASCUS/LSIL)in 42 cases,atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion/high-grade squamous intraepithelial lesions(ASC-H/HSIL)in 41 cases, and squamous cell carcinoma(SCC)in 9 cases.The positive rates of Ki67,PHH3 and p16 in ASCUS/LSIL patients were 19.05%,4.76%and 26.19%,respectively,which were significantly lower than those of ASC-H/HSIL patients(85.37%, 88.89%,88.89%),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The diagnostic sensitivity and specificity for cervical cancer and precancerous lesions were 90.32%(56/62)and 86.84%(33/38)for p16,83.87%(52/62)and 89.47%(34/38)for Ki67,and 70.97%(44/62),100.00%(38/38)for PHH3.The positive expression rate of HPV-L1 in ASCUS/LSIL patients was 69.05%,significantly higher than that ofASC-H/HSIL patients(0),and the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionPHH3,Ki67,p16 combined detection can serve as auxiliary screening means for exfoliated cervical cells,which can effectively improve the diagnostic accuracy of cervical cancer and precancerous lesions.Detection of HPV-L1 can divert the degree of pathological change of ASCUS/SLIL and provide some guidance for clinical treatment.

Exfoliated cervical cell;Mitosis-specific antibody;Human papillomavirus;Cervical cancer

R711.74

A

1003—6350（2016）21—3464—03

2016-04-23)

黃平。E-mail：youping77731@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.008