Treg/TH17細(xì)胞因子的平衡作用與不同中醫(yī)癥候HBV宮內(nèi)感染相關(guān)性研究

栗軍香，王銀茹，李阿靜，郝曉麗，耿靜，賈麗霞

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056002；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲056002；3.邯鄲市婦幼保健院功能科，河北邯鄲056001；4.涉縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲056400；5.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北邯鄲056002；6.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室,河北邯鄲056002)

Treg/TH17細(xì)胞因子的平衡作用與不同中醫(yī)癥候HBV宮內(nèi)感染相關(guān)性研究

栗軍香1，王銀茹2，李阿靜3，郝曉麗4，耿靜5，賈麗霞6

（1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056002；2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲056002；3.邯鄲市婦幼保健院功能科，河北邯鄲056001；4.涉縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲056400；5.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北邯鄲056002；6.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室,河北邯鄲056002)

目的探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)/輔助性T細(xì)胞17(Thl7)的平衡作用及其與不同中醫(yī)癥候乙型肝炎病毒(HBV)宮內(nèi)感染的相關(guān)性。方法選擇2014年10月至2015年12月期間在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院分娩的單胎足月孕婦及其新生兒各100例，根據(jù)是否發(fā)生HBV宮內(nèi)感染分為對(duì)照組(未發(fā)生HBV，n=50)和觀察組(發(fā)生HBV，n=50)。觀察組孕婦根據(jù)不同中醫(yī)癥候分為肝郁脾虛型、濕熱中阻型、瘀血阻絡(luò)型、肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型5組，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組孕婦外周血和新生兒臍血Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞的表達(dá)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)兩組Treg和TH17相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和IL-17的水平。結(jié)果觀察組孕婦和新生兒Treg和TH17細(xì)胞的表達(dá)及IL-10和IL-17水平[孕婦分別為(7.92±1.41)%、(5.64±1.61)%、(316.4±32.3)g/mL、(321.6±30.7)g/mL；新生兒分別為(6.53±1.14)%、(5.11±1.35)%、(298.3±35.4)g/mL、(316.7±28.9)g/mL]均明顯高于對(duì)照組[孕婦分別為(5.87±1.55)%、(3.19±0.47)%、(153.2±31.5)g/mL、(193.4±21.5)g/mL；新生兒分別為(4.02±1.52)%、(2.98±0.38)%、(141.5±26.1)g/mL、(181.6±23.3)g/mL]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組孕婦和新生兒的IL-17/IL-10[(1.01±0.13)、(1.05±0.12)]均小于對(duì)照組[(1.31± 0.12、1.30±0.11)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組5種不同中醫(yī)癥候組間IL-17/IL-10比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，從高到低依次為肝郁脾虛型、濕熱中阻型、瘀血阻絡(luò)型、肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型[孕婦分別為(1.25±0.16)、(1.11±0.15)、(0.97±0.14)、(0.83±0.14)、(0.69±0.1)；新生兒分別為(1.22±0.15)、(1.03±0.16)、(0.93±0.15)、(0.81±0.13)、(0.64±0.15)]。結(jié)論發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的孕婦和新生兒Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)均增強(qiáng)，Treg細(xì)胞的增幅高于TH17細(xì)胞，IL-17/IL-10細(xì)胞因子的免疫失衡可能是引起HBV宮內(nèi)感染的因素之一。

Treg細(xì)胞；TH17細(xì)胞；不同中醫(yī)癥候；乙型肝炎病毒；宮內(nèi)感染

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬于一種嗜肝DNA病毒,是目前全球最常見(jiàn)也是危害最嚴(yán)重的傳染性疾病。我國(guó)是乙肝大國(guó),HBV感染率高,并極易引起肝硬化、肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]，對(duì)HBV感染的有效預(yù)防和治療是一個(gè)公認(rèn)的難題。母嬰垂直傳播是HBV感染傳播的主要途徑之一，其中以宮內(nèi)感染常見(jiàn),而目前有關(guān)HBV宮內(nèi)感染的機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞和Thl7細(xì)胞可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡作用，Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用,Thl7細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用，二者平衡的破壞與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。而中醫(yī)理論認(rèn)為疾病的發(fā)生發(fā)展是正邪雙方的失衡所致，因此，認(rèn)為機(jī)體免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的功能強(qiáng)弱可能與HBV宮內(nèi)感染的不同中醫(yī)辨證分型有關(guān)，故本研究通過(guò)研究孕婦及其新生兒Treg/ TH17細(xì)胞因子的平衡作用，探討HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生機(jī)制，尋找降低宮內(nèi)感染的新方向，并為其中醫(yī)辨證分型提供一定指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年10月至2015年12月期間在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院行產(chǎn)前檢查和分娩的單胎足月孕婦及其新生兒各100例作為研究對(duì)象，按照是否發(fā)生HBV宮內(nèi)感染分為觀察組和對(duì)照組，觀察組50例孕婦及其新生兒發(fā)生HBV宮內(nèi)感染，對(duì)照組50例孕婦及其新生兒未發(fā)生HBV宮內(nèi)感染。所有孕婦經(jīng)檢測(cè)均為HBsAg陽(yáng)性，但肝功正常。排除具有先兆流產(chǎn)或早產(chǎn)史者；有病原體感染史及其他妊娠合并癥者；近期服用抗病毒或激素藥物者；患有其他病毒性肝炎或非病毒性肝炎及嚴(yán)重全身疾患者；排除胎兒先天畸形和配偶HBV攜帶者。對(duì)出生新生兒的臍帶血進(jìn)行檢測(cè)，以HBsAg陽(yáng)性和(或)HBV-DNA陽(yáng)性確定為發(fā)生HBV宮內(nèi)感染。其中觀察組新生兒中大三陽(yáng)(HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+)21例，小三陽(yáng)(HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+)29例，對(duì)照組新生兒中大三陽(yáng)20例，小三陽(yáng)30例。兩組孕婦的年齡、孕周、孕次、分娩方式及新生兒性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集采集所有孕婦空腹靜脈血2管，3 mL/管，其中1管于24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞的表達(dá)，另1管以3 000 r/min，離心10 min，將上清置于EP管中，-80℃保存，以進(jìn)行IL-10和IL-17水平檢測(cè)。新生兒臍帶結(jié)扎切斷后,抽取臍靜脈血三管,每管3 mL，進(jìn)行乙肝五項(xiàng)及HBV-DNA、Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞、IL-10和IL-17水平的檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法新生兒臍血乙肝五項(xiàng)測(cè)定采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀應(yīng)用ELISA法進(jìn)行定量測(cè)定，檢測(cè)試劑購(gòu)自武漢眾生生物工程有限公司；采用熒光定量PCR法進(jìn)行臍血HBV-DNA的檢測(cè)，試劑購(gòu)自珠海賽樂(lè)奇生物技術(shù)公司；采用美國(guó)BD流式細(xì)胞儀應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定孕婦血和臍血Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞表達(dá)；應(yīng)用ELISA法測(cè)定孕婦血和臍血IL-10和IL-17。均嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.3 中醫(yī)癥型分型標(biāo)準(zhǔn)參考中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科肝病專業(yè)委員會(huì)1991年天津會(huì)議制定的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》,將觀察組孕婦及其新生兒分為濕熱中阻型、肝郁脾虛型、肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型和瘀血阻絡(luò)型5種證候,每組10例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)，不同中醫(yī)癥型的多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦和新生兒Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞表達(dá)與對(duì)照組比較,觀察組孕婦外周血和新生兒臍血Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞所占CD4+淋巴細(xì)胞的比例均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 兩組孕婦和新生兒IL-10和IL-17水平比較觀察組孕婦和新生兒IL-10和IL-17的水平均明顯高于對(duì)照組，而IL-17/IL-10比值則明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表1 兩組孕婦和新生兒Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞的表達(dá)比較(±s,%)

表1 兩組孕婦和新生兒Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞的表達(dá)比較(±s,%)

組別孕婦新生兒Treg細(xì)胞TH17細(xì)胞Treg細(xì)胞TH17細(xì)胞觀察組(n=50)對(duì)照組(n=50) t值P值7.92±1.41 5.87±1.55 6.917＜0.01 5.64±1.61 3.19±0.47 10.329＜0.01 6.53±1.14 4.02±1.52 9.341＜0.01 5.11±1.35 2.98±0.38 10.739＜0.01

2.3 不同中醫(yī)癥型孕婦和新生兒IL-10和IL-17水平比較5種不同中醫(yī)癥候HBV宮內(nèi)感染的孕婦和新生兒的IL-17/IL-10存在差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-17/IL-10比值從高到低依次為肝郁脾虛型、濕熱中阻型、瘀血阻絡(luò)型、肝腎陰虛型、脾腎陽(yáng)虛型(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組孕婦和新生兒IL-10和IL-17的水平比較(±s)

表2 兩組孕婦和新生兒IL-10和IL-17的水平比較(±s)

組別孕婦新生兒觀察組(n=50)對(duì)照組(n=50) t值P值IL-10(pg/mL) 316.4±32.3 153.2±31.5 25.578＜0.01 IL-17(pg/mL) 321.6±30.7 193.4±21.5 24.187＜0.01 IL-17/IL-10 1.01±0.13 1.31±0.12 11.980＜0.01 IL-10(pg/mL) 298.3±35.4 141.5±26.1 25.209＜0.01 IL-17(pg/mL) 316.7±28.9 181.6±23.3 25.734＜0.01 IL-17/IL-10 1.05±0.12 1.30±0.11 10.859＜0.01

表3 不同中醫(yī)癥型孕婦和新生兒IL-10和IL-17的水平比較(±s)

表3 不同中醫(yī)癥型孕婦和新生兒IL-10和IL-17的水平比較(±s)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與肝郁脾虛型組比較，bP＜0.05；與濕熱中阻型比較，cP＜0.05；與瘀血阻絡(luò)型比較，dP＜0.05；與肝腎陰虛型比較，eP＜0.05。

組別孕婦新生兒IL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)IL-17/IL-10IL-10(pg/mL)IL-17(pg/mL)IL-17/IL-10觀察組濕熱中阻(n=10)肝郁脾虛(n=10)肝腎陰虛(n=10)脾腎陽(yáng)虛(n=10)瘀血阻絡(luò)(n=10)對(duì)照組(n=50) F值P值1.03±0.16abd1.22±0.15abd0.81±0.13abcd0.64±0.15abcde0.93±0.15abc1.30±0.11 21.877＜0.001 321.2±30.6 301.8±29.4 366.5±34.2 382.6±35.1 351.3±32.7 153.2±31.5 10.309＜0.001 356.5±33.4 375.9±36.2 304.2±30.4 262.1±30.5 341.2±31.8 193.4±21.5 19.347＜0.001 1.11±0.15abd1.25±0.16acd0.83±0.14abcd0.69±0.17abcde0.97±0.14abc1.31±0.12 21.084＜0.001 330.9±29.8 315.2±28.5 359.3±32.8 376.1±34.2 344.7±30.6 141.5±26.1 5.782＜0.001 341.7±33.9 384.2±34.1 291.4±30.3 241.7±28.6 320.5±32.4 181.6±23.3 28.094＜0.001

3 討論

人體感染HBV后,通過(guò)特定的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或免疫復(fù)合物作用而造成機(jī)體細(xì)胞損害[3]。目前，西醫(yī)辨病和中醫(yī)辨證相結(jié)合是臨床對(duì)乙肝診治的一種新的思維方法，且逐漸成為一種發(fā)展趨勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為慢性乙肝的病因主要是外感濕熱疫毒和內(nèi)因正氣虧虛，正氣虧虛不勝邪，致使疾病發(fā)生，日久損傷氣血臟腑，使機(jī)體出現(xiàn)氣血陰陽(yáng)不和，而導(dǎo)致脾虛、肝郁、氣滯及血瘀[4]。HBV宮內(nèi)感染是指乙肝或乙肝攜帶者的孕婦在圍產(chǎn)期通過(guò)母嬰途徑將HBV傳播給胎兒，這與中醫(yī)的“胎毒”學(xué)說(shuō)相一致。

中醫(yī)中的正氣與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抵抗力類似，如正氣盛機(jī)體抵御外邪的能力強(qiáng)，不易發(fā)??；而正氣虧則機(jī)體對(duì)外邪的防御能力就弱，濕熱疫毒乘虛侵入而致發(fā)病。因此,人體免疫功能強(qiáng)弱與中醫(yī)正氣盛衰、辨證分型存在相關(guān)性[5]。目前雖然臨床工作者不斷研究探討,中醫(yī)對(duì)HBV感染的辨證分型還缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有五種癥型和六種癥型兩種，以五種癥型標(biāo)準(zhǔn)較多。而1991年的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)是目前被廣泛接受和使用較多的標(biāo)準(zhǔn)[6]，本研究也是參考該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)HBV宮內(nèi)感染進(jìn)行的中醫(yī)辨證分型。因此，進(jìn)一步研究HBV宮內(nèi)感染的免疫細(xì)胞特點(diǎn)及與中醫(yī)證型的相關(guān)性，可以對(duì)HBV感染的辨證分型提供客觀的和量化的指標(biāo)和指導(dǎo)價(jià)值。

大量研究表明Th1/Th2細(xì)胞系統(tǒng)的免疫平衡紊亂是HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的可能機(jī)制之一[7]。近年，發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞系統(tǒng)的另外兩種細(xì)胞即Treg/TH17細(xì)胞的免疫失衡參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。Treg為具有抗炎作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，IL-10、TGF-βI是其發(fā)揮免疫作用的主要細(xì)胞因子；TH17為具有促炎作用的輔助性T細(xì)胞，IL-17是其主要的效應(yīng)細(xì)胞因子，參與多種慢性疾病的發(fā)生。當(dāng)機(jī)體正常狀態(tài)時(shí)，Treg/ TH17細(xì)胞系統(tǒng)之間存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)機(jī)體伴有炎癥時(shí)，IL-6會(huì)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，導(dǎo)致前炎癥反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果顯示觀察組孕婦外周血和新生兒臍血Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞所占CD4+淋巴細(xì)胞的比例均明顯高于對(duì)照組，IL-10和IL-17的水平均顯著高于對(duì)照組,而IL-17/IL-10比值顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的孕婦和新生兒Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞均表達(dá)增強(qiáng)，其相關(guān)細(xì)胞因子水平也上升。IL-17/IL-10比值降低，說(shuō)明兩種細(xì)胞之間存在著一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在HBV的感染過(guò)程中,隨著Treg細(xì)胞的高表達(dá)則會(huì)抑制Thl7細(xì)胞亞群的增殖，從而造成Treg/TH17細(xì)胞的免疫失衡，會(huì)進(jìn)一步加重疾病的進(jìn)展[10]。本研究顯示5種中醫(yī)證型的HBV宮內(nèi)感染孕婦和新生兒的IL-17/IL-10比值也有顯著差異，以脾腎陽(yáng)虛證IL-17/IL-10的失衡最嚴(yán)重，而該癥型患者的病程最長(zhǎng)，病情也最重。

綜上所述，Treg/TH17細(xì)胞因子的免疫失衡可能參與HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生，IL-17/IL-10的失衡可能是HBV宮內(nèi)感染發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。Treg/TH17細(xì)胞因子的平衡作用與不同中醫(yī)證型的HBV宮內(nèi)感染存在一定相關(guān)性，可指導(dǎo)HBV感染的中醫(yī)辨證分型，同時(shí)可進(jìn)一步研究如何通過(guò)降低孕婦體內(nèi)Treg細(xì)胞表達(dá)來(lái)降低HBV宮內(nèi)感染的發(fā)生率。

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Relationship between the balance of Treg/TH17 cytokines and the intrauterine infection of HBV in different TCM syndromes.

LI Jun-xiang1,WANG Yin-ru2,LI A-jing3,HAO Xiao-li4,GENG Jing5,JIA Li-xia6.1.Department of Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002, Hebei,CHINA;3.Department of Function,Handan Maternal and Child Health-Care Hospital,Handan 056001,Hebei, CHINA;4.Department of Obstetrics and Gynecology,Shexian County People's Hospital,Handan 056400,Hebei,CHINA; 5.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA; 6.Department of Biochemistry,Faculty of Medicine of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells(Treg)/helper T cell 17(Thl7)and its correlation with the intrauterine infection of hepatitis B virus(HBV)in different traditional Chinese medicines(TCM)syndromes.MethodsA total of 100 single fetus full-term pregnant women and their newborns coming from Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering from October 2010 to December 2015 were divided into the control group (n=50)and observation group(n=50)according to whether the occurrence of HBV intrauterine infection.The observation group was divided into liver and spleen deficiency type,damp heat resistance type,blood stasis type,liver and kidney deficiency type,spleen and kidney yang deficiency type 5 groups according to different TCM syndrome.The expression of Treg cells and TH17 cells in peripheral blood of pregnant women and umbilical cord blood of were detected by flow cytometry,and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the level of cytokines IL-10 and IL-17 that related to TH17 and Treg in the two groups.ResultsThe expression of Treg and TH17 cells and the levels of IL-10 and IL-17 of pregnant women and newborn in the observation group were(7.92±1.41)%,(5.64±1.61)%, (316.4±32.3)g/mL,(321.6±30.7)g/mL,(6.53±1.14)%,(5.11±1.35)%,(298.3±35.4)g/mL,(316.7±28.9)g/mL,respectively,which were significantly higher than these of pregnant women and newborn in the control group of(5.87±1.55)%,(3.19±0.47)%,(153.2±31.5)g/mL,(193.4±21.5)g/mL,(4.02±1.52)%,(2.98±0.38)%,(141.5±26.1)g/mL,(181.6±23.3)g/mL respectively,with statistically significant differences(P＜0.05).The IL-17/IL-10 of pregnant women and newborn in the observation group were significantly lower than control group,and the difference was statistically significant(P＜0.05). The IL-17/IL-10 of pregnant women and newborn in the observation group were(1.01±0.13),(1.05±0.12)respectively, which were significantly lower than those in the observation group of(1.31±0.12),(1.30±0.11),P＜0.05.The IL-17/ IL-10 of five different TCM syndrome group in the observation group were significantly different(P＜0.05),from high to low,followed by liver and spleen deficiency type,damp heat resistance type,blood stasis type,liver and kidney deficiency type,spleen and kidney yang deficiency type.The IL-17/IL-10 of five different TCM syndrome group in pregnant women were(1.25±0.16),(1.11±0.15),(0.97±0.14),(0.83±0.14),(0.69±0.1),respectively,which were respectively (1.22±0.15),(1.03±0.16),(0.93±0.15),(0.81±0.13)and(0.64±0.15)in newborn.ConclusionThe expression of Treg and TH17 cells and the levels of associated cytokines in pregnant women and newborns with HBV intrauterine infection are increasing,and Treg cells is higher than TH17 cells,the immune imbalance of IL-17/IL-10 probably one of the factors of HBV intrauterine infection.

Treg cell;TH17 cell;Different traditional Chinese medicine syndrome;Hepatitis B virus(HBV);Intrauterine infection

R512.6+2

A

1003—6350（2016）21—3448—04

2016-04-25)

河北省邯鄲市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：0823108061-3)

栗軍香。E-mail：lijunxiang11235@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.003