降糖通脈片對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的修復(fù)作用*

宋新龍，魯碧楠，蘇冷高娃，陳 書，張耀丹，龐宗然

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

降糖通脈片對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的修復(fù)作用*

宋新龍，魯碧楠，蘇冷高娃，陳 書，張耀丹，龐宗然△

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

目的:觀察降糖通脈片對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的修復(fù)作用并探討其可能的作用機制。方法:將40只昆明種小鼠按隨機數(shù)字表法分成空白對照組、模型組、降糖通脈片組、陽性對照組(水飛薊賓膠囊)4組各10只。預(yù)防性灌胃給藥5 d后，通過腹腔注射0.2%CCl4花生油溶液，建立小鼠急性肝損傷模型，測定小鼠血清中ALT、AST、TG、TBIL、LDH和ALP水平及肝組織中MDA含量和SOD活力，計算肝臟指數(shù)并對肝組織進行病理學(xué)檢查。結(jié)果:降糖通脈片組能降低CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和血清中ALT、AST等指標水平，降低肝臟組織中MDA的含量，增強SOD的活力。通過病理學(xué)檢測，降糖通脈片組能明顯改善肝臟組織的病理變化。結(jié)論:降糖通脈片對四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷具有顯著的修復(fù)作用，其作用機制可能與清除體內(nèi)自由基和抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

降糖通脈片;急性肝損傷;四氯化碳;氧化應(yīng)激

降糖通脈片是臨床經(jīng)常用來治療2型糖尿病的中成藥制劑，主要用于由氣陰不足、瘀血阻絡(luò)所致的2型糖尿病具備多飲、多尿、多食、消瘦等典型三多一少癥狀的患者［1］。本實驗室前期研究結(jié)果顯示，降糖通脈片不僅具有較好的降糖作用，而且能夠顯著降低2型糖尿病小鼠血清ALT和AST活性。目前對降糖通脈片的使用與研究僅限于糖尿病，對降糖通脈片的肝保護作用和其作用機制的研究報道甚少。本實驗建立由CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷模型是常見的一種化學(xué)性肝損傷模型，考察降糖通脈片對急性肝損傷的修復(fù)作用及其機制。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明種SPF級雄性小鼠，體質(zhì)量22 g～25 g，由中國食品藥品檢定研究院提供(動物合格證號SCXK(京)2014-0013)。

1.2 試劑與藥品

降糖通脈片由江蘇萬高藥業(yè)有限公司提供，稱取降糖通脈片10 g研磨至粉末，用適當倍體積的二蒸水超聲溶解，最終得到0.063 g·mL－1藥液。

氯化鈉、無水乙醇、冰醋酸及四氯化碳均購自北京化工廠;水飛薊賓膠囊購自天士力制藥集團股份有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)試劑均購自中生北控生物制劑科技股份有限公司;丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白含量測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究院;腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素1(IL-1β)Elisa測定試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 主要儀器

全自動生化分析儀(日立公司，日本);電熱恒溫水浴鍋(榮華儀器制造有限公司，江蘇);UV-4802H型紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司，上海);BioTek多功能酶標儀(伯騰儀器有限公司，美國)。

2 方法

2.1 分組及給藥方法

將40只小鼠按隨機數(shù)字表法分成空白對照組(Control)、模型組(Model)、降糖通脈片組(JT)和陽性對照組(Silibinin)4組各10只。降糖通脈片組灌胃給予0.63 g·kg－1降糖通脈片水溶液，陽性對照組灌胃給予54.6 mg·kg－1水飛薊賓膠囊水溶液，正常對照組和模型組灌胃給予等劑量蒸餾水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d。第5天給藥2 h后，模型組、降糖通脈片組、陽性對照組小鼠分別腹腔注射0.2%(v/v)CCl4花生油溶液，正常對照組小鼠注射等量花生油，隨后禁食不禁水。

2.2 標本采集與制備

造模23 h后眼眶取血，將血液于4℃、3500 rpm離心12 min制備血清，用于檢測各組小鼠血清中生化指標(ALT、AST、TBIL、TG、LDH、ALP)及炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的含量。同時立即脫臼處死小鼠取肝臟，用4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗表面浮血，濾紙拭干、稱重計算肝臟指數(shù)。取小鼠肝臟最大葉置于10%福爾馬林中固定用于病理學(xué)檢查。稱取0.2 g肝臟組織，剪碎放于玻璃勻漿器中，加預(yù)冷的9倍體積生理鹽水勻漿，3000 rpm離心10 min，上清液置4℃保存?zhèn)溆?，按照Elisa試劑盒說明測定肝臟組織中MDA、SOD水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，2組間均數(shù)采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 降糖通脈片對肝臟指數(shù)(Liver index)的影響

表1顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著升高(P＜0.05)，說明模型組肝臟增大。與模型組比較，降糖通脈片組肝臟指數(shù)顯著降低(P＜0.05)，說明降糖通脈片對由CCl4導(dǎo)致的小鼠肝臟腫脹有一定的緩解作用。

3.2 降糖通脈片對肝臟組織中MDA和SOD的影響

表1顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝臟MDA含量明顯升高(P＜0.05)，SOD活性顯著降低(P＜0.05)，再次證實本實驗小鼠急性肝損傷造模型成功。與模型組比較，降糖通脈片組肝組織中SOD的活性明顯升高(P＜0.05)，MDA的水平顯著降低(P＜0.05)。與水飛薊賓膠囊陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，作用效果相當。結(jié)果顯示，降糖通脈片具有一定的保肝活性，對肝損傷有明顯的改善作用。

表1 降糖通脈片對小鼠肝臟指數(shù)以及血清中MDA和SOD的影響

3.3 降糖通脈片對血清中ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP的影響

與空白對照組比較，模型組血清中ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP水平明顯升高(P＜0.05)，證實本實驗小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組比較，降糖通脈片組小鼠血清ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP水平明顯降低(P＜0.05)，與水飛薊賓膠囊陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，作用效果相當。

表2 降糖通脈片對血清中的ALT、AST、TBIL、TG、LDH和ALP的影響

3.4 降糖通脈片對血清中IL-1β、IL-6和TNF- α含量的影響

圖3顯示，與空白對照組比較，模型組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯升高(P＜0.05)，證實本實驗小鼠急性肝損傷造模成功。與模型組比較，降糖通脈片組小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低(P＜0.05)，與水飛薊賓膠囊陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，作用效果相當。

表3 降糖通脈片對血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響

3.5 降糖通脈片對肝組織病理變化的影響

肝臟組織HE染色顯示，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝臟組織完整，未見異常變化。而模型組盡管肝臟組織結(jié)構(gòu)輪廓尚且存在，但血管周圍出現(xiàn)大量炎性浸潤，肝細胞變性、壞死。與模型組比較，降糖通脈片和水飛薊賓不同程度地改善CC14誘導(dǎo)肝損傷中肝細胞炎性浸潤、水腫、變性、壞死等病理改變。

肝臟組織油紅O染色顯示，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝臟組織完整，未見異常變化和脂滴沉積。而模型組盡管肝臟組織結(jié)構(gòu)輪廓尚且存在，但在門靜脈周圍出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積和肝細胞脂肪變性。與模型組比較，降糖通脈片和水飛薊賓不同程度改善了CC14誘導(dǎo)的肝損傷中肝細胞脂滴沉積與脂肪變性等病理改變。

4 討論

降糖通脈片的主要成分為太子參、黃芪、黃精、天冬、麥冬、玄參、天花粉、蒼術(shù)、知母、葛根、黃連、丹參、益母草、赤芍、水蛭、川牛膝、雞血藤、威靈仙、荔枝核、地龍和川芎，其功效為益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、通絡(luò)活絡(luò)，主要用于氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)所致的消渴，多飲、多食、多尿消瘦、乏力以及2型糖尿病具備以上癥狀的患者。中醫(yī)學(xué)認為，急性肝損傷其發(fā)病機制為外來毒邪是病因，正虛是發(fā)病的關(guān)鍵，血瘀是主要證候，因此祛毒增液、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀可謂是治療急性肝損傷的基本治法。雖然在降糖通脈片中解毒藥不多，但益氣、養(yǎng)陰、增液、活血的藥比較多，因此根據(jù)“有是證用是藥”的原則，降糖通脈片具有一定的肝損傷修復(fù)作用。同時在實驗中也偶然發(fā)現(xiàn)，降糖通脈片對2型糖尿病小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶具有降低作用，因此初步得知降糖通脈片對肝臟具有保護作用，但需要進一步深入研究其保護作用及其機制。因此，經(jīng)查閱文獻采用CCl4急性肝損傷模型為本研究的研究對象，CCl4急性肝損傷模型是經(jīng)典的肝損傷模型，常被用來篩選具有肝保護作用的藥物［4］。CCl4進入機體后，經(jīng)肝臟細胞色素P450代謝產(chǎn)生三氯甲基自由基和過氧三氯甲基自由基，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，造成肝細胞脂質(zhì)過氧化損傷。脂質(zhì)過氧化損傷破壞肝細胞膜的完整性，從而導(dǎo)致肝細胞的AST和ALT釋放入血，因此血清AST和ALT活性水平被認為是肝損傷最敏感的金指標，并被廣泛應(yīng)用于對急性肝損傷的診斷［5］。研究結(jié)果顯示，降糖通脈片以0.063 g"mL－1的劑量對小鼠進行預(yù)處理，能顯著降低AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP的活性，說明降糖通脈片具有明顯的肝保護作用。為進一步深入探討降糖通脈片的肝保護作用機制，本研究對肝損傷小鼠的肝臟MDA和SOD水平、血清中炎癥因子與肝臟形態(tài)進行了分析。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，肝損傷越嚴重其含量越高，MDA還可以增加細胞膜通透性，加速肝損傷過程［6-9］。SOD是機體抗氧化應(yīng)激的酶防御體系中的重要酶，能有效地清除體內(nèi)自由基，保護機體組織免受自由基的攻擊［10-14］;炎癥反應(yīng)在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷過程中扮演著重要角色。自由基可激活單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子(TNF-α)，TNF-α能引起肝細胞壞死，并可激活Bax和Fas等基因表達引起肝細胞凋亡，且能介導(dǎo)脂類介質(zhì)、多肽介質(zhì)(IL-6、IL-1β)和氧自由基而引起肝損傷［15-16］。因此，抑制MDA水平并增加SOD活性與降低TNF-α等炎癥因子表達水平，能夠拮抗CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷作用。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP活性顯著升高。同時病理檢查結(jié)果顯示，肝組織出現(xiàn)明顯的病理變化，說明CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型造模成功。降糖通脈片預(yù)處理小鼠后再給予CC14溶液，結(jié)果顯示降糖通脈片能夠顯著降低由CCl4導(dǎo)致升高的AST、ALT、TBIL、TG、LDH和ALP活性，并能顯著緩解肝細胞變性壞死和炎性浸潤等病理性改變，說明降糖通脈片對CC14誘導(dǎo)的急性肝損傷具有明顯的修復(fù)作用。同時降糖通脈片不僅能降低肝損傷小鼠的MDA水平，并能恢復(fù)甚至提高SOD的活性，且能顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平，提示降糖通脈片很可能是通過抗氧化和抗炎機制來實現(xiàn)其肝損傷修復(fù)作用的。

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Repair Function of Jiangtang Tongmai Tablet to the Acute Liver Injury Induced by Carbon Tetrachloride in Mice

SONG Xin-long，LU Bi-nan，SULENG-GAOWA，CHEN Shu，ZHANG Yao-dan，PANG Zong-ran△
(Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Mizu University of China，Beijing 100081，China)

Objective To evaluate the protective effect of Jiang Tang Tong Mai Tablet on carbon tetrachloride(CCL4) induced acute liver injury in mice and its possible mechanism as well．Method:The 40 mice were randomly divided into normal control，model group，JT group，then there is silibinin group(n=10)．The mouse model of acute liver injury was established by injecting 0.2%CCl4，after five days preventive administration．The serum levels of ALT，AST，TBIL，TG，LDH and ALP were determined，and the mice were killed to calculate the index of liver．MDA and SOD were detected in the liver homogenate．Histopathological changes of the liver were observed by HE and Oil red staining．Result JT reduce the liver index in mice insignificantly，decreased the level of ALT，AST，TBIL，TG，LDH and ALP in serum and the content of MDA in the liver homogenate，furthermore increased the activity of SOD in liver tissue．Conclusion:JT could protect the acute liver damage induced by CCL4and its mechanism may be related to the elimination of free radicals and anti-oxidative stress．

JT;Acute Liver Injury;Carbon tetrachloride;Oxidative stress;

R285.5

B

1006-3250(2016)02-0188-03

2015-05-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(81273921);教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”資助項目(IRT0871);中央民族大學(xué)自主科研項目

宋新龍(1985-)，男，河北曲陽人，在讀碩士，從事2型糖尿病病機與中醫(yī)藥干預(yù)研究。

△通訊作者:龐宗然(1966-)，男，河北承德人，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機制與中醫(yī)藥干預(yù)研究，E-mail:zrpang@163．com。