冠心病血瘀證的基因網(wǎng)絡(luò)模塊研究?

袁野，申春悌，胡鏡清

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州醫(yī)院，江蘇常州213000; 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京100700)

冠心病血瘀證的基因網(wǎng)絡(luò)模塊研究?

袁野1，申春悌2△，胡鏡清3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州醫(yī)院，江蘇常州213000; 3.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京100700)

目的:探討冠心病血瘀證基因網(wǎng)絡(luò)中重要模塊的生物學(xué)功能與通路。方法:搜索文獻(xiàn)中冠心病血瘀證相關(guān)基因，并運(yùn)用CYTOSCAPE進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，MCODE進(jìn)行模塊劃分后再對(duì)重要模塊進(jìn)行功能與通路分析。結(jié)果:冠心病血瘀證網(wǎng)絡(luò)中BCL2、VEGFA、IL-6、JUN和IL-8具有重要作用。血管平滑肌增殖和toll樣受體信號(hào)通路分別是網(wǎng)絡(luò)中最重要的生物學(xué)過程與通路。結(jié)論:該研究既體現(xiàn)了冠心病血瘀證基因的整體特點(diǎn)，又關(guān)注了基因網(wǎng)絡(luò)的局部差異，為冠心病的預(yù)防與治療提供了新的思路。

冠心病;血瘀證;網(wǎng)絡(luò);模塊

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病，現(xiàn)代研究表明，本病的發(fā)生與血液黏度增高、血小板聚集增強(qiáng)致微循環(huán)障礙相關(guān)［1］。有研究證實(shí)，本病以活血化瘀藥治療具有較好的臨床療效［2-3］。冠心病中醫(yī)文獻(xiàn)中，血瘀證是其最常見的證型［4］。

目前已有較多對(duì)本病血瘀證的研究，如殷惠軍等研究發(fā)現(xiàn)，冠心病血瘀證差異基因IL-8具有激活血小板的作用［5］。毛以林等探討了ACE基因插入/缺失(insertion/deletion，I/D)多態(tài)性與冠心病血瘀證的關(guān)系［6］。這些研究關(guān)注了冠心病血瘀證患者單個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的上調(diào)或下降，探討了基因在疾病中的相關(guān)作用機(jī)制。但疾病的發(fā)生是整體的紊亂，是多個(gè)基因參與的多靶點(diǎn)、多通路的改變。2007年《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報(bào)道了與冠心病密切相關(guān)的幾個(gè)基因位點(diǎn)，在這幾個(gè)基因位點(diǎn)單獨(dú)或者聯(lián)合作用下，冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)大為增加［7］。如何從諸多基因之間探索它們的聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為我們提供了可行的方法。本研究在之前學(xué)者研究方法的基礎(chǔ)上，通過對(duì)文獻(xiàn)中冠心病血瘀證相關(guān)基因的分析及建模，進(jìn)一步探索網(wǎng)絡(luò)中局部基因之間的聯(lián)系，力圖從現(xiàn)代科學(xué)的角度進(jìn)一步挖掘證的實(shí)質(zhì)。

1 文獻(xiàn)來源

1.1 文獻(xiàn)檢索方法

以“冠心病”、“血瘀證”、“基因”為關(guān)鍵詞，檢索CNKI、CBM、維普、萬方等中文數(shù)據(jù)庫，包含期刊和碩博論文。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)有明確的疾病和血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)發(fā)表或數(shù)據(jù)不完整的文獻(xiàn);會(huì)議摘要和評(píng)論及不能獲得完整數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)。

2 研究方法

2.1 基因網(wǎng)絡(luò)分析

基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Agilent Literature Search。一款搜索文獻(xiàn)中與研究相關(guān)基因的軟件，并在搜索結(jié)果的基礎(chǔ)上構(gòu)建相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscap插件可生成網(wǎng)絡(luò)概括圖。

2.2 模塊劃分

在構(gòu)建冠心病相關(guān)網(wǎng)絡(luò)后，運(yùn)用MCODE插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分，以發(fā)現(xiàn)局部網(wǎng)絡(luò)中重要性及聯(lián)系更為密切的基因。MCODE最初是用來檢測(cè)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一種聚類算法，能夠在大規(guī)模的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)里檢測(cè)出緊密連接的區(qū)域(即分子復(fù)合物)?，F(xiàn)在該方法也可用于在其他類型的網(wǎng)絡(luò)中檢測(cè)出聚類，如基因的聚類［8］。

2.3 功能富集與通路查詢

在劃分模塊之后，本研究又對(duì)前三重要模塊的重疊基因進(jìn)行了功能分析，采用DAVID 6.7(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov/)軟件對(duì)各組的模塊進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路查詢。

3 結(jié)果

將119個(gè)基因?qū)階gilent Literature Search后，與冠心病血瘀證關(guān)系密切的另外493個(gè)基因被挖掘出，總共612個(gè)節(jié)點(diǎn)1834條邊構(gòu)成了冠心病血瘀證的整體基因網(wǎng)絡(luò)。其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)基因，邊的存在表明基因與基因之間具有關(guān)聯(lián)性。

將整體網(wǎng)絡(luò)分用MCODE進(jìn)行模塊劃分，共有51個(gè)模塊，模塊的重要性根據(jù)模塊性(由節(jié)點(diǎn)數(shù)、邊數(shù)及介數(shù)中心性決定)排列，其中模塊1與模塊2的重要性明顯高于其他模塊。

模塊1共30個(gè)基因156條邊，BCL2、JUN、IL-6和VEGFA是擁有邊最多的基因(圖1)。模塊2共15個(gè)基因81條邊，IL-8、TNFA、MMP12是擁有邊最多的基因(圖2)。

表1顯示，對(duì)最重要的2個(gè)模塊進(jìn)行富集分析與通路查詢，發(fā)現(xiàn)模塊1共有224個(gè)GO功能，10條KEGG通路;模塊2共有98個(gè)GO功能，4條KEGG通路。

表1 模塊1與模塊2中最有意義的生物學(xué)過程及通路。

圖1 M CODE最重要的模塊1

圖2 M CODE第二重要的模塊2

4 討論

網(wǎng)絡(luò)中的邊代表基因之間存在聯(lián)系，邊越多則聯(lián)系越廣泛，基因的重要性越強(qiáng)。MCODE模塊1中邊最多的4個(gè)基因是BCL2、VEGFA、IL-6和JUN，那么可以認(rèn)為這4個(gè)基因在模塊1中對(duì)其生物學(xué)功能及通路具有重要影響。通過功能富集發(fā)現(xiàn)，模塊1最重要的生物學(xué)功能與通路分別是血管平滑肌增殖和toll樣受體信號(hào)通路。

之前Nair等研究了冠心病炎癥因子層面的整體關(guān)聯(lián)，從整體網(wǎng)絡(luò)中找到了重要的節(jié)點(diǎn)及生物學(xué)過程。發(fā)現(xiàn)白介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF)和前列腺素過氧化物合成酶2(PTGS2)是網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，其中白介素6具有最大的度及最高的介數(shù)中心性，JUN是最重要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄因子。Smooth muscle cell proliferation(血管平滑肌增殖)，acute-phase response(急性階段反應(yīng))，calcidiol 1-monooxygenase activity(單氧化酶活性)是最重要的3個(gè)生物學(xué)過程。toll-like receptor signaling pathway(toll樣受體信號(hào)通路)，NOD-like receptor signaling pathway(NOD樣受體信號(hào)通路) and regulation of phosphorylation(調(diào)控磷酸化)是最重要的信號(hào)通路［9］。

本研究結(jié)果顯示，VEGFA、IL-6和JUN基因，血管平滑肌增殖過程及toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路同樣參與了冠心病血瘀證的病理過程，表明冠心病血瘀證與其炎癥反應(yīng)存在一定的關(guān)系。

本研究顯示，血管平滑肌增殖是模塊1中最重要的生物學(xué)過程。血瘀證的治療大法以活血化瘀為主。目前已有許多研究表明，活血化瘀藥物可以改善冠心病心肌缺血狀態(tài)下血管平滑肌增殖的過程。劉擎發(fā)現(xiàn)，活血化瘀類中藥三棱的提取化合物SsnB作為一種新的選擇性toll樣受體2和toll樣受體4拮抗劑，可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化的形成與進(jìn)展中的血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、炎癥反應(yīng)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀類中藥紅花和丹參均具有改善心肌供血、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的藥理作用［11-12］。由丹參和紅花有效成分制成的丹紅注射液通過降低血漿內(nèi)皮素(ET)水平，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［13］。

同時(shí)4個(gè)重要基因也與平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。Wang等發(fā)現(xiàn)，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖可以提高動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性，這與減少炎癥因子TNF及IL-6表達(dá)相關(guān)［14］。Li等認(rèn)為，CD59表達(dá)上調(diào)可以預(yù)防平滑肌細(xì)胞增殖對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化并促進(jìn)BCL2的表達(dá)［15］。趙曙炎等發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以單獨(dú)或通過其代謝產(chǎn)物脫水淫羊藿素上調(diào)血管形成相關(guān)基因VEGFA、MMP-2和IL-8基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生［16］。

研究發(fā)現(xiàn)，模塊1的toll樣受體信號(hào)通路與冠心病有較大聯(lián)系。Zhai等發(fā)現(xiàn)，toll樣受體4在心肌缺血再灌注的大鼠模型中調(diào)控炎癥反應(yīng)，并參與逆轉(zhuǎn)心肌重塑的機(jī)制［17］。而具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的銀丹心腦通，通過調(diào)控toll樣受體信號(hào)通路及降低IL-1β、IL-8、d IL-18等炎癥因子對(duì)抗心肌缺血再灌注的損傷［18］。目前的研究證實(shí)，基因BCL2、VEGFA、IL-6、JUN及平滑肌細(xì)胞增殖和toll樣受體信號(hào)通路參與了冠心病的疾病過程，但未有研究表明這些重要基因與該生物學(xué)過程、信號(hào)通路相互之間同時(shí)存在聯(lián)系。該研究表明，它們?cè)诠谛牟⊙鲎C中的作用重要且聯(lián)系密切。

模塊2中邊最多的基因是IL8，最重要的生物學(xué)過程與通路分別是調(diào)控凋亡和NOD2信號(hào)通路。Han等發(fā)現(xiàn)，甘草查爾酮B在心臟缺血再灌注的過程中具有抗凋亡、抗炎的保護(hù)作用，可能與其降低IL-8的表達(dá)相關(guān)［19］。Stump f等認(rèn)為，丹參用于冠心病患者時(shí)具有抗炎作用，這種作用可能與其顯著降低IL8、IL6在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)［20］。IL6作為模塊1的重要基因同樣與模塊2的生物學(xué)過程相關(guān)。同樣MMP9也是模塊1的組成基因，與模塊2的重要通路相關(guān)。NOD2信號(hào)通路在心肌梗死中具有重要作用，它的減少可以對(duì)抗心肌梗死后的心臟重塑，其機(jī)制是減少了細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞浸潤及降低MMP9活性［21］。

IL6與IL8均為各自模塊的重要基因，但I(xiàn)L6所在模塊為冠心病中最重要的模塊，因此IL6在冠心病血瘀證中的作用更為關(guān)鍵。

隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來，與疾病相關(guān)的基因研究迅速涌現(xiàn)，因此從海量的文獻(xiàn)中挖掘出信息的關(guān)聯(lián)性也變得愈加復(fù)雜。網(wǎng)絡(luò)分析的方法幫助研究者對(duì)之前的研究進(jìn)行了整體性回顧與串聯(lián)。值得肯定的是，該研究方法既體現(xiàn)了冠心病血瘀證基因的整體特點(diǎn)，又關(guān)注了基因網(wǎng)絡(luò)的局部差異。模塊與模塊之間并不是孤立的，其構(gòu)成的基礎(chǔ)是在整體網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)的情況下，內(nèi)部的聯(lián)系更為密切。如IL6和IL8它們是各自模塊的重要組成基因，具有最多的邊，同時(shí)又有邊聯(lián)系于其他模塊，并與外部模塊的通路、基因或功能相關(guān)聯(lián)。

該研究找到了冠心病血瘀證最重要的基因模塊及其中的重要基因，若能在此基礎(chǔ)上探索有效的同時(shí)干預(yù)這幾個(gè)重要靶基因的方藥，則可為疾病的診斷與治療提供新的思路。

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Study on Genetic Network Module of Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart Disease

YUAN Ye1，SHEN Chun-ti2△，HU Jing-Qing3
(1.Nanjing university of Chinese medicine，Nanjing 210023，China; 2.Changzhou hospital affiliated to Nanjing university of Chinese medicine，Changzhou 213000，China; 3.Basic Theory Institute of Chinese Medicine，CACMS，Beijing 100700，China)

Objective: Blood stasis is the predominant syndrome of coronary heart disease(CHD) ，however，there still lack of a genetic landscape of it．We are aiming to explore the biological processes and pathways of blood stasis of coronary heart disease．Methods: We obtained genes from the literatures and applied Agilent Literature Search for network construction，MCODE for modularized analysis．After that，a functional enrichment analysis was performed to find the biological processes and pathways of the most important modules．Results: 119 Blood stasis-related genes were found from the literatures and were used to mining more potential related genes．Totally，other 489 genes were found correlated to the blood stasis of CHD，612 nodes and 1834 edges consist of the whole network．Each node represents one gene，and edge means there is connection between the genes．Bcl2、VEGFA、IL-6、IL-8 and JUN play important roles in the network for they owning the most edges．Regulation of smooth muscle cell proliferation is the most important biological process of the significant module，toll-like receptor signaling is the most important pathway of it．Conclusion: Our findings are considerably in accord with previous research show that network analysis is an useful and stable tool．It allowed us to gain a better understanding of the pathological mechanism of the blood stasis of CHD．

Coronary Heart Disease;Blood Stasis;Netwok;Module

R541.4

:A

:1006-3250(2016)05-0642-03

2015-11-14

973課題“基于冠心病痰瘀互結(jié)證辨證方法的創(chuàng)新研究”(2014CB542903)

袁野(1987-)，男，江蘇南京人，醫(yī)學(xué)博士，從事從事中醫(yī)證候研究。

△通訊作者:申春悌(1949-)，女，江蘇常州人，醫(yī)學(xué)學(xué)士，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)證候的臨床與研究，Tel: 13906126896，E-mail:czsct@163.com。