果樹轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

王新平，茹慧玲，孫慧英，王新生，楊兆亮，楊雪瑞

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太谷030800）

果樹轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

王新平，茹慧玲，孫慧英，王新生，楊兆亮，楊雪瑞

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太谷030800）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在果樹遺傳改良方面具有重要意義。目前已報道的轉(zhuǎn)基因方法幾乎都能成功得到轉(zhuǎn)基因植株，但不同的方法間轉(zhuǎn)化效率存在很大差異，且對不同的果樹而言，同一方法的轉(zhuǎn)化效率也不盡相同。迄今為止，主要的轉(zhuǎn)基因方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和外源基因直接導(dǎo)入法兩大類，且以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用最為廣泛。文章對這2種方法及取得的成果進(jìn)行了闡述，并對研究中存在的問題提出了建議和展望，以期為果樹品種改良提供依據(jù)。

果樹；轉(zhuǎn)基因；農(nóng)桿菌；Ti質(zhì)粒；外源基因

我國自商代開始栽培果樹，1949年開始進(jìn)行果樹育種研究，傳統(tǒng)的育種方法主要有引種、選優(yōu)、實(shí)生選種、雜交選種、輻射誘變和芽變等[1]。果樹的童期長、雜合度高、自交不親和等問題，給育種工作造成很大困難。1983年煙草轉(zhuǎn)基因植株的成功獲得[2]，為果樹的遺傳改良開辟了一條新的途徑。1988年，McGranahan等[3]成功獲得了具有GUS基因的核桃轉(zhuǎn)基因植株，成為世界首例轉(zhuǎn)基因果樹。轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種的結(jié)合，不僅使果樹的育種周期變短、后代選擇穩(wěn)定，而且增強(qiáng)了育種的目的性，大大提高了育種效率。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，已出現(xiàn)多種植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)[4]，且其在果樹育種方面的應(yīng)用也日益廣泛，并取得了很大進(jìn)展。

筆者對果樹轉(zhuǎn)基因方面取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述，以期為果樹品種改良提供參考。

1 果樹常用轉(zhuǎn)基因方法

目前，有關(guān)果樹轉(zhuǎn)基因的方法已有很多報道，且已報道的方法都能成功得到轉(zhuǎn)基因植株。但不同的轉(zhuǎn)基因方法間轉(zhuǎn)化效率存在很大差異，即使同一種方法，對不同的果樹而言，其轉(zhuǎn)化效率也不盡相同。了解各種轉(zhuǎn)基因方法，在眾多方法中選擇針對某一果樹的最適方法，并對影響其轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，提高遺傳轉(zhuǎn)化率，是轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于果樹遺傳改良的關(guān)鍵。迄今為止，主要的轉(zhuǎn)基因方法有兩大類：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和外源基因直接導(dǎo)入法。

1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前使用最為廣泛的體系[5]，該方法以農(nóng)桿菌為媒介，將目的基因通過載體上的特定區(qū)域?qū)爰?xì)胞，并整合到染色體中[6-7]。常用的農(nóng)桿菌菌株主要有發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhyzogines）和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。其中，根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒應(yīng)用最為廣泛，該方法出現(xiàn)較早、技術(shù)成熟、轉(zhuǎn)化效率高、操作簡單，加之絕大多數(shù)的果樹對農(nóng)桿菌較為敏感，因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成為果樹轉(zhuǎn)基因的主要方法[8]，目前得到的轉(zhuǎn)基因果樹中絕大多數(shù)是通過這一方法實(shí)現(xiàn)的。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已在核桃[3，9-10]、葡萄[11-15]、蘋果[16-22]、草莓[23-28]、梨[29-30]、柑橘[31-34]等果樹上取得成功。McGranahan等[3]首次利用核桃的體胚發(fā)生系統(tǒng)進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)移，成功獲得了抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化效率低，方法繁瑣。Dandekar等[9]對轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了改進(jìn)，McGranahan等[10]于1990年采用這一方法再次獲得核桃轉(zhuǎn)基因植株，且提高了轉(zhuǎn)化效率，加快了選擇進(jìn)度。1989年，黃學(xué)森等[11]利用改進(jìn)的Ti質(zhì)粒為載體，獲得了具有卡那霉素抗性和胭脂堿合成酶基因（NOS基因）的葡萄轉(zhuǎn)基因植株，成為我國首例成功轉(zhuǎn)入外源基因并使其性狀表達(dá)的果樹。此后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在葡萄上的應(yīng)用日益廣泛，目前獲得的絕大多數(shù)抗病毒轉(zhuǎn)基因葡萄都是通過此方法獲得的[12]。李金鳳等[13]研究表明，葡萄砧木5BB在農(nóng)桿菌侵染4 min、共培養(yǎng)2 d時，不定芽的再生率和GUS瞬時表達(dá)率均較高。此外，采取一些輔助手段，如共培養(yǎng)前對受體材料進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以及添加乙酰丁香酮（AS）可提高轉(zhuǎn)化效率[14-15]。蘋果的轉(zhuǎn)基因研究始于1989年，James等[16]首次獲得的轉(zhuǎn)基因綠袖蘋果，此后相繼在M26[17]、元帥[18]、嘎啦、Braeburn[19]、Elstar[20]、富士[21]等眾多個品種中取得成功。張志宏[22]研究認(rèn)為，對于喬納金蘋果的葉片而言，琥珀堿型菌株EHA105遠(yuǎn)比章魚堿型菌株LBA4404的轉(zhuǎn)化率要高。繼核桃和蘋果之后，草莓是世界上第3個獲得轉(zhuǎn)基因植株的果樹[23]。1990年Nehra等[24-26]以Redcoat的愈傷組織和葉盤為材料，成功將GUS基因和NptⅡ基因?qū)氩葺仓辏D(zhuǎn)化率分別為3%和6.5%。此后，James等[27]以雙元Ti質(zhì)粒載體pBIN6和pSS1轉(zhuǎn)化草莓的葉片和葉柄，獲得了再生植株。Oosumi等[28]以森林草莓種子萌發(fā)42～49 d、未展開的三小葉為材料，將hpt基因?qū)氩葺?，并獲得100%的轉(zhuǎn)化率。梨的轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，1996年Mourgues等[29]首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得具有外源GUS基因和NptⅡ基因的康弗倫斯梨，且轉(zhuǎn)化率高達(dá)42.7%。此后，在帕西、杜康、Bourre Bosc、杜梨等品種中也取得成功[30]。1989年Kobayashi等[31]以柑橘原生質(zhì)體為受體，成功獲得轉(zhuǎn)基因的胚性愈傷組織，此后，柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化研究取得了較大發(fā)展，先后在枳、甜橙、寬皮橘、柚、檸檬等柑橘類果樹中獲得轉(zhuǎn)基因植株[32]。1998年Cervera等[33]首次用成年甜橙的新抽枝條為受體，獲得轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化率較實(shí)生苗低，此后中國農(nóng)科院國家柑橘品種改良中心以甜橙成年樹的腋芽作為轉(zhuǎn)化材料，將轉(zhuǎn)化率提高到了10%[34]。

1.2 外源基因直接導(dǎo)入法

與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不同，外源基因直接導(dǎo)入法是通過一定的技術(shù)手段和方法可直接將目的基因?qū)胧荏w或組織細(xì)胞，從而方便快捷地完成植物的基因轉(zhuǎn)化[35]。目前，果樹上常用的外源基因直接導(dǎo)入法主要有電擊法和基因槍法。

1.2.1 電擊法也叫電穿孔法，其原理是以瞬時高壓電脈沖作用于植物細(xì)胞，使細(xì)胞膜產(chǎn)生微孔，從而促進(jìn)外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并與植物基因組進(jìn)行整合。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，電擊法適用于所有的細(xì)胞，且操作簡單快捷、可直接將目的基因?qū)胧荏w的原生質(zhì)體中，但該方法需要昂貴的儀器，細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，且穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。目前，由電擊法獲得的轉(zhuǎn)基因果樹有草莓[36]、柑橘[37]、蘋果[38]等。1992年，Nyman等[36]對草莓原生質(zhì)體進(jìn)行20 ms 400 V/cm的電擊，在10 μg/mL的潮霉素選擇壓獲得具有GUS基因的草莓愈傷組織。Hidaka等[37]于1993年利用電擊法將GUS基因?qū)敫涕儆鷤M織，但沒有獲得再生植株。Hyung等[38]對富士蘋果進(jìn)行30 ms 200 V/cm的電擊，使GUS基因在葉肉原生質(zhì)體中瞬時表達(dá)。

1.2.2 基因槍法基因槍法是指把含有目的基因的金屬顆粒高速射入受體細(xì)胞中，使外源基因與受體細(xì)胞的基因重組，從而獲得轉(zhuǎn)化植株。該方法可用于任何植物組織，且報告基因的瞬時表達(dá)便于分析基因表達(dá)的組織特異性，但獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率較低。Klein等[39]最早采用該方法將煙草的RNA導(dǎo)入洋蔥細(xì)胞，目前利用該方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的果樹有蘋果、葡萄、香蕉、荔枝等[40]。Yao等[41]利用基因槍法將GUS基因?qū)腴勹值膽腋〖?xì)胞中，并指出將細(xì)胞用高滲溶液預(yù)處理后可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。Hebert等[42]用包有GUS基因和NptⅡ基因的微粒轟擊葡萄胚性培養(yǎng)物，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。Scorza等[43-44]先用基因槍轟擊無核白葡萄體細(xì)胞胚2次后，再與含外源基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，從而獲得具有報告基因、Shirva-1基因或番茄環(huán)斑病毒CP基因的植株。

2 問題與展望

經(jīng)過眾多科研工作者近30 a的努力，果樹的轉(zhuǎn)基因研究已取得很大的成就，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變的農(nóng)藝性狀主要集中在提高抗病蟲能力、提高抗逆性、縮短童期、促進(jìn)樹體矮化、分枝與生根以及增強(qiáng)果實(shí)耐儲性等方面。但是迄今為止，果樹的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因轉(zhuǎn)移、遺傳選擇、高頻再生體系建立等方面仍然存在一定的困難。由于轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因植株再生率低等技術(shù)原因，目前獲得的商品化轉(zhuǎn)基因果樹很少，遠(yuǎn)不如其他轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。針對這些問題，在今后的研究中，應(yīng)該探索研發(fā)高效的轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)基因果樹的應(yīng)用性；此外，還應(yīng)加大具有某種特殊功能的目的基因分離克隆的研究力度，如與果實(shí)產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等相關(guān)的基因，不應(yīng)局限于轉(zhuǎn)化現(xiàn)有的目的基因。隨著果樹分子生物學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，將有更多的功能基因應(yīng)用到果樹育種中，并最終將這些技術(shù)成果應(yīng)用到大田生產(chǎn)中。

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Research Progress of Transgenic Fruit Trees

WANG Xin-ping，RU Hui-ling，SUN Hui-ying，WANG Xin-sheng，YANG Zhao-liang，YANG Xue-rui
（Institute of Pomology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taigu 030800，China）

The transgenic technology has important significance in the genetic improvement of fruit trees.Almost all transgenic method that have been reported can be used to obtain transgenic plants.There were differences between the different methods,and the transformation efficiency of the same method was not the same for different fruit trees.There were two major categories of transgenic method,Agrobacterium-Mediated and direct induction of exogenous DNA.The method most widely used was Agrobacterium-Mediated. In this paper,the two methods and the research results were described,and the existing problems and the research prospects were also discussed to provide the basis for the improvement of fruit varieties.

fruit trees;transgenic;Agrobacterium；plasmid Ti;exogenous gene

S66

A

1002-2481（2016）01-0123-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.32

2015-08-12

王新平（1974-），女，山西祁縣人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事果樹育種與生物技術(shù)研究工作。