褪黑素治療黃體功能不全的作用機(jī)制研究進(jìn)展

蔣小飛，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210029)

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褪黑素治療黃體功能不全的作用機(jī)制研究進(jìn)展

蔣小飛，周惠芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210029)

氧化應(yīng)激在黃體功能不全(LPD)發(fā)病過(guò)程中占有重要的作用。褪黑素具有強(qiáng)大的氧自由基清除和抗氧化能力，可用于改善LPD患者黃體功能及體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞質(zhì)量。

褪黑素；黃體功能不全；氧自由基；氧化應(yīng)激；輔助生殖技術(shù)

不孕癥是臨床三大難治疾病之一，其中3.5%～10%是由黃體功能不全(LPD)導(dǎo)致的[1]。隨著國(guó)內(nèi)晚婚年齡的提高以及二胎政策的放開(kāi)，受孕年齡不斷增加，LPD所致的不孕率逐年提高，給臨床造成了很大的困擾。目前LPD的臨床治療主要包括促進(jìn)卵泡發(fā)育、促進(jìn)月經(jīng)中期黃體生成素(LH)峰的形成、黃體功能刺激療法和黃體功能替代療法。盡管目前治療策略已確立，但治療效果仍不滿(mǎn)意。研究[2～5]發(fā)現(xiàn)，氧自由基(ROS)是導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降及黃體期缺陷的重要因素。針對(duì)其病因治療，選擇一種恰當(dāng)?shù)腞OS清除劑顯得尤為必要。褪黑素作為一種強(qiáng)大的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑[6]，因其體積小且有高度親脂親水的雙向特性，得到臨床的廣泛重視[7]?，F(xiàn)就褪黑素治療LPD的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 褪黑素治療LPD的機(jī)制

1.1 ROS在LPD發(fā)病中的作用 LPD是指卵巢排卵后形成的黃體內(nèi)分泌功能不足，以致孕激素分泌不足，使子宮內(nèi)膜由增生期向分泌期轉(zhuǎn)化不足，子宮內(nèi)膜容受性下降，不利于受精卵的著床，進(jìn)而導(dǎo)致不孕或習(xí)慣性流產(chǎn)。其主要原因是卵泡發(fā)育不良和排卵后卵巢黃體形成缺陷。眾所周知，ROS參與多種細(xì)胞的生理病理過(guò)程，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和分化，同時(shí)還在細(xì)胞凋亡或壞死過(guò)程中發(fā)揮重要作用。過(guò)量ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)或DNA氧化損傷。因此，ROS的不良作用幾乎存在于人類(lèi)所有的疾病，如癌癥、神經(jīng)退化和慢性炎性疾病等[2]。在女性生殖方面，排卵是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，此過(guò)程伴隨著類(lèi)似炎癥的過(guò)程，表現(xiàn)為前列腺素合成的增加、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、蛋白水解酶的作用，并伴隨血管通透性的增加。ROS是這些炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，主要包括超氧化物、過(guò)氧化氫和羥基，線(xiàn)粒體是其主要來(lái)源。適量的ROS是卵泡成熟的必須條件，如線(xiàn)粒體內(nèi)ROS參與氧化磷酸化過(guò)程為胚泡向減數(shù)分裂Ⅱ期的轉(zhuǎn)化提供能量，促進(jìn)卵泡發(fā)育，但過(guò)剩的ROS可能參與氧化應(yīng)激，損傷線(xiàn)粒體，并抑制三磷酸腺苷的合成，減少卵泡發(fā)育的供能，從而導(dǎo)致卵泡發(fā)育不良，而卵泡內(nèi)低三磷酸腺苷濃度與卵泡質(zhì)量低下的關(guān)系已得到證實(shí)[3,4]。過(guò)剩的ROS還可通過(guò)損傷黃體細(xì)胞膜脂質(zhì)，破壞DNA，誘使細(xì)胞凋亡[2]，促進(jìn)黃體的退化。其對(duì)顆粒細(xì)胞的損傷作用，會(huì)造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，同時(shí)通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶及線(xiàn)粒體內(nèi)膽固醇的運(yùn)輸降低黃體細(xì)胞合成孕激素[5]，從而造成LPD。Dai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，攝入三聚氰胺的小鼠卵泡內(nèi)ROS增多，影響細(xì)胞骨架、凋亡、自噬誘導(dǎo)及表觀遺傳的修飾，最終導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖，從而降低小鼠的生育能力。Bedaiwy等[9]對(duì)138例接受卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)的不孕患者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，受孕患者卵泡內(nèi)的總抗氧化能力遠(yuǎn)高于受孕失敗的患者，這一證據(jù)表明卵泡內(nèi)的ROS過(guò)程對(duì)生殖的干預(yù)不可忽視。此外，許多臨床證據(jù)證實(shí)極端的體質(zhì)量和生活方式因素(如吸煙、飲酒、吸毒)可以促進(jìn)自由基的產(chǎn)生過(guò)剩，從而影響生育[10]。ROS及其清除劑之間的失衡可導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降及黃體期缺陷[11]，這可能是女性不孕的一個(gè)重要因素。針對(duì)其病因治療，選擇一種恰當(dāng)?shù)腞OS清除劑尤為必要，故而褪黑素得到了越來(lái)越多的關(guān)注。

1.2 褪黑素抗ROS的作用機(jī)制 褪黑素主要是由松果體分泌的一種吲哚類(lèi)化合物，具有廣泛的生理學(xué)效應(yīng)，在延緩衰老、改善睡眠、抗擊腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及調(diào)節(jié)生殖方面得到廣泛的應(yīng)用[12]。褪黑素對(duì)生殖系統(tǒng)的作用機(jī)制主要通過(guò)相關(guān)膜受體及核受體作用于生殖軸各層面?，F(xiàn)代研究證實(shí)，褪黑素除了與其受體MT1和MT2結(jié)合發(fā)揮作用外，還可以直接與ROS相互作用，也可以改變酶抗氧化劑的活性間接消除自由基，其清除羥基自由基(·OH)的能力是谷胱甘肽的5倍，是甘露醇的8倍[13]。褪黑素更容易穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如線(xiàn)粒體和細(xì)胞核，并呈高濃度聚集，預(yù)防和減少線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激，從而減少后續(xù)的細(xì)胞凋亡[7]。褪黑素作用于線(xiàn)粒體，可增加線(xiàn)粒體內(nèi)電子傳遞效率，有效減少ROS生成，緩解DNA損傷[14]。更為重要的是，褪黑素可增強(qiáng)體內(nèi)其他抗氧化劑的作用，如增加超氧化物歧化酶(SOD)mRNA的表達(dá)，提高SOD活性，間接清除O2-。此外，褪黑素還可增強(qiáng)谷胱甘肽的活性，使H2O2分解增加，減少·OH的生成[15]。褪黑激素還可上調(diào)SOD、抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因p53及Caspase-3的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡及ROS生成[16]。基于以上特性，褪黑素越來(lái)越廣泛應(yīng)用于多種涉及氧化應(yīng)激的疾病，如糖尿病、腸易激綜合征、化療后腦損傷等。

1.3 褪黑素治療LPD的機(jī)制 哺乳動(dòng)物體內(nèi)顆粒細(xì)胞中存在褪黑素受體[17]，這預(yù)示顆粒細(xì)胞可能是褪黑素作用于卵巢的一個(gè)作用靶點(diǎn)。褪黑素在人卵巢組織中的水平遠(yuǎn)高于血液，且排卵前大卵泡內(nèi)的褪黑素水平高于小卵泡[18]，提示褪黑素在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中起重要作用。Manca等[19]研究發(fā)現(xiàn)，松果體切除后繼發(fā)的褪黑素缺乏，導(dǎo)致了卵泡數(shù)量下降和黃體平面面積減少，并降低了黃體生成類(lèi)固醇的能力，從側(cè)面證明了褪黑素對(duì)卵子成熟的重要作用。

卵泡局部產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β家族全程參與卵泡生長(zhǎng)的調(diào)控[20]。其中由顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素樣生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)卵泡的有絲分裂并起到抗凋亡的作用，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子可以刺激DNA的合成并促進(jìn)顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞產(chǎn)生雌激素和孕激素。研究[21]表明，褪黑素能夠刺激顆粒細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子，進(jìn)而誘導(dǎo)其受體激活兩條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路：一是PI3K/AKT通路，其主要參與細(xì)胞代謝；二是MEK/ERKs通路，其主要參與細(xì)胞的增殖及分化。

2 褪黑素治療LPD的應(yīng)用效果

目前無(wú)論是超促排卵方案還是促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑或拮抗劑的應(yīng)用均會(huì)導(dǎo)致LPD，已成為共識(shí)。臨床一般采用HCG、孕酮、雌激素等藥物治療進(jìn)行相應(yīng)治療，褪黑素已被嘗試應(yīng)用于輔助生殖療程中。

2.1 體內(nèi)應(yīng)用 臨床在輔助生殖過(guò)程中使用褪黑素可以明顯改善黃體功能，改善妊娠預(yù)后。Eryilmaz等[22]采用褪黑素治療合并睡眠障礙的不孕患者，治療后與未服用褪黑素的對(duì)照組相比，睡眠狀態(tài)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但得到的卵母細(xì)胞的平均數(shù)、平均減數(shù)分裂Ⅱ期卵母細(xì)胞數(shù)、G1的胚胎比例顯著高于對(duì)照組。研究[23]表明，在促排卵后口服褪黑素能夠顯著增加黃體期孕酮水平，改善黃體功能。Tamura等[24]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)進(jìn)行體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)治療的不孕女性于前次月經(jīng)前第5天口服補(bǔ)充褪黑激素直至取卵日，所獲得優(yōu)質(zhì)胚胎明顯高于未補(bǔ)充褪黑素的對(duì)照組。這一點(diǎn)在動(dòng)物試驗(yàn)中也得到了證實(shí)，Wang等[25]在梅花鹿超促排卵治療的研究中發(fā)現(xiàn)，皮下注射應(yīng)用褪黑素顯著提高了血清卵泡刺激素(FSH)水平，LH峰值顯著高于對(duì)照組基線(xiàn)水平，顯著降低血清泌乳素水平，其中治療組平均黃體數(shù)量顯著高于對(duì)照組。以上諸多研究均從單一褪黑素角度探討了其對(duì)LPD的作用。Pacchiarotti等采用褪黑素聯(lián)合肌醇、葉酸對(duì)照單純給予肌醇、葉酸治療不孕癥，3個(gè)月后進(jìn)行ICSI治療，治療組獲取成熟卵母細(xì)胞、優(yōu)質(zhì)胚胎獲得率顯著高于對(duì)照組。上述研究結(jié)果表明，褪黑素可能參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育。

2.2 體外應(yīng)用 哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞有一個(gè)復(fù)雜的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)于溫度和滲透壓的變化敏感。離體卵母細(xì)胞失去富含抗氧化物卵泡液的保護(hù)，而在低溫貯藏保存條件下，過(guò)量產(chǎn)生的活性氧可繼發(fā)ROS從而損傷卵母細(xì)胞[26]，活性氧導(dǎo)致黃體顆粒細(xì)胞分泌孕激素量下降，導(dǎo)致LPD，使妊娠轉(zhuǎn)歸不良，而合并使用褪黑素可解除過(guò)氧化氫對(duì)黃素化顆粒細(xì)胞對(duì)孕酮分泌的抑制作用，改善其預(yù)后。有研究[27]發(fā)現(xiàn)自排卵后8 h，卵母細(xì)胞即開(kāi)始出現(xiàn)氧化應(yīng)激，并呈時(shí)效相關(guān)的指數(shù)增長(zhǎng)，在體外培養(yǎng)人受精卵時(shí)加入1 mmol/L褪黑素干預(yù)，可明顯緩解卵母細(xì)胞的ROS損傷，與未使用褪黑素的對(duì)照組相比，治療組發(fā)育到囊胚階段的受精卵數(shù)目明顯增多。Rocha等[27]用不同濃度的褪黑素及FSH進(jìn)行干預(yù)體外培養(yǎng)的山羊排卵前卵泡，結(jié)果表明應(yīng)用褪黑素及FSH有助于保護(hù)山羊排卵前卵泡超微結(jié)構(gòu)的完整，從而改善妊娠預(yù)后。Wei等[29]將凍存的人胚泡278例和停于減數(shù)分裂Ⅰ期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為6組以不同濃度的褪黑素進(jìn)行干預(yù)，分別于6、12、18、24、48 h評(píng)估卵子成熟情況，最終發(fā)現(xiàn)劑量為1 nmol/L的褪黑素培育24 h時(shí)可獲得最佳培育效果，而高濃度組培育24 h卵細(xì)胞成熟率最低，提示高濃度的卵泡外褪黑素在一定程度上抑制卵母細(xì)胞的成熟。同期，KK等[30]報(bào)道與其一致。上述研究報(bào)道表明，褪黑素可在體外培養(yǎng)中改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。

綜上所述，作為L(zhǎng)PD的輔助治療藥物，褪黑素有其獨(dú)特的抗氧化作用及可靠的安全性，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有廣闊的前景。

[1] 體功能不全性不孕癥的中西醫(yī)臨床研究進(jìn)展[J].四川中醫(yī)，2013，32(5):156-158.

[2] Tamura H, Takasaki A, Taketani T, et al. Melatonin as a free radical scavenger in the ovarian follicle[J]. Endocr J, 2013,60(1):1-13.

[3] Zeng HT, Ren Z, Yeung WS, et al. Low mitochondrial DNA and ATP contents contribute to the absence of birefringent spindle imaged with PolS cope in in vitro matured human oocytes[J]. Hum Reprod, 2007,22(6):1681-1686.

[4] Reiter RJ, Rosales-Corral SA, Manchester LC, et al. Peripheral reproductive organ health and melatonin: ready for prime time[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(4):7231-7272.

[5] Behrman HR, Kodaman PH, Preston SL, et al. Oxidative stress and ovary[J]. J Soc Gynecol Investig， 2001,8(1 Suppl Proceedings):S40-42.

[6] Srinivasan V, Spence WD, Pandiperumal SR, et al. Melatonin and human reproduction: shedding light on the darkness hormone[J]. Gynecol Endocrinol, 2009,25(12):779-785.

[7] Paradies G, Petrosillo G, Paradies V, et al. Melatonin, cardiolipin and mitochondrial bioenergetics in health and disease[J]. J Pineal Res, 2010,48(4):297-310.

[8] Dai XX, Duan X, Cui XS, et al. Melamine induces oxidative stress in mouse ovary[J]. PLoS One, 2015,10:e0142564

[9] Bedaiwy MA, Elnashar SA, Goldberg JM, et al. Effect of follicular fluid oxidative stress parameters on intracytoplasmic sperm injection outcome[J]. Gynecol Endocrinol, 2011,28(1):51-55.

[10] Agarwal A, Aponte-Mellado A, Premkumar BJ, et al. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2012,10(1):141-185.

[11] Scarpellini F, Mastrone M, Sbracia M, et al. Serum lipoperoxide level variations in normal and luteal phase defect cycles[J]. Gynecol Obstet Invest,1996,42(1):28-30.

[12] Reiter RJ, Tan DX, Galano A. Melatonin: exceeding expectations[J]. Physiology, 2014,29(5):325-333.

[13] Reiter RJ, Tan DX, Rosales-Corral S, et al. The universal nature, unequal distribution and antioxidant functions of melatonin and its derivatives[J]. Mini Rev Med Chem, 2013,13(3):373-384.

[14] El-Raey M, Geshi M, Somfai T, et al. Evidence of melatonin synthesis in the cumulus oocyte complexes and its role in enhancing oocyte maturation in vitro in cattle[J]. Mol Reprod Dev, 2011,78(4):250-262.

[15] Pandi-Perumal SR, Bahammam AS, Brown GM, et al. Melatonin antioxidative defense: therapeutical implications for aging and neurodegenerative processes[J]. Neurotox Res, 2013,23(3):267-300.

[16] Wang F, Tian X, Zhang L, et al. Melatonin promotes the in vitro development of pronuclear embryos and increases the efficiency of blastocyst implantation in murine[J]. J Pineal Res, 2013,55(3):267-274.

[17] Salhab M, Dhorne-Pollet S, Auclair S, et al. In vitro maturation of oocytes alters gene expression and signaling pathways in bovine cumulus cells[J]. Mol Reprod Dev, 2013,80(2):166-182.

[18] Hiroshi T, Akihisa T, Toshiaki T, et al. Melatonin and female reproduction[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2014,40(1):1-11.

[19] Manca ME, Manunta ML, Spezzigu A, et al. Melatonin deprival modifies follicular and corpus luteal growth dynamics in a sheep model[J]. Reproduction, 2014,147(6):885-895.

[20] Stubbs SA, Webber LJ, Stark J, et al. Role of Insulin-like growth factors in initiation of follicle growth in normal and polycystic human ovaries[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013,98(8):3298-3305.

[21] Picinato MC, Hirata AE, Cipolla-Neto J, et al. Activation of insulin and IGF-1 signaling pathways by melatonin through MT1 receptor in isolated rat pancreatic islets[J]. J Pineal Res, 2008,44(1):88-94.

[22] Eryilmaz OG, Devran A, Sarikaya E, et al. Melatonin improves the oocyte and the embryo in IVF patients with sleep disturbances,but does not improve the sleeping problems[J]. J Assist Reprod Genet, 2011,28(9):815-820.

[23] Taketani T, Tamura H, Takasaki A, et al. Protective role of melatonin in progesterone production by human luteal cells[J]. J Pineal Res, 2011,51(2):207-213.

[24] Tamura H, Takasaki A, Taketani T, et al. Melatonin as a free radical scavenger in the ovarian follicle[J]. Endocr J, 2013,60(1):1-13.

[25] Wang L, Zhuo ZY, Shi WQ, et al. Melatonin promotes superovulation in sika deer (Cervusnippon)[J]. Int Mol Sci, 2014,15(7):12107-12118.

[26] Huang B, Li Z, Ai J, et al. Antioxidant capacity of follicular fluid from patients undergoing in vitro fertilization[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(5):2273-2282.

[27] Szocs F, Rostasova O, Tiňo J, et al. Melatonin prevents postovulatory oocyte aging in the mouse and extends the window for optimal fertilization in vitro[J]. Biol Reprod, 2013,88(3):570-578.

[28] Rocha RM, Lima LF, Alves AM, et al. Interaction between melatonin and follicle-stimulating hormone promotes in vitro development of caprine preantralfollicles[J]. Domest Anim Endocrinol, 2013,44(1):1-9.

[29] Wei D, Zhang C, Xie J, et al. Supplementation with low concentrations of melatonin improves nuclear maturation of human oocytes in vitro[J]. J Assist Reprod Genet, 2014,31(5):933-938.

[30] Kim MK, Park EA, Kim HJ, et al. Does supplementation of in-vitro culture medium with melatonin improve IVF outcome in PCOS[J]. Reprod Biomed Online, 2013,26(1):22-29.

國(guó)家科學(xué)自然基金資助項(xiàng)目(81473713)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141463)。

周惠芳(E-mail： zhouhuifang2011301@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.036

R711.6

A

1002-266X(2016)35-0105-03

2016-06-29)