miRNA調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化作用研究

張文明，張媛媛，林燕萍（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

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miRNA調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化作用研究

The effects of imRNA in regulating osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

張文明，張媛媛，林燕萍
（福建中醫(yī)藥大學，福建福州350122）

關(guān)鍵詞成骨分化；miRNA；BMSCs

miRNA是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能作用的單鏈小RNA。從1993年在秀麗線蟲發(fā)育時期發(fā)現(xiàn)第一個miRNA后，miRNA的研究取得巨大突破，目前在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)數(shù)量龐大的miRNA，并且觀察到miRNA具有極其豐富的生物學功能，對生物體的發(fā)育代謝凋亡過程均具有調(diào)控作用。miRNA是一種非編碼的小RNA，長度約為19～25個核苷酸，具有高度保守性。大約占到整個人類基因組的1%，調(diào)控人類30%以上基因的表達。參與各種生物體細胞早期發(fā)育和生長、增殖、分化、分裂以及凋亡，并且參與重要基因的調(diào)控、體液調(diào)節(jié)、組織重建、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，對疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸都具有重要影響［1-3］。其在多種生物體內(nèi)具有高度保守性，在不同的生物體系均起著關(guān)鍵作用，促進快速應答與機體生理和結(jié)構(gòu)的精確調(diào)控。它們基于與靶基因的3′非翻譯區(qū)序列互補，從而對靶基因進行降解或抑制，達到調(diào)控蛋白質(zhì)表達的目的。

1 miRNA的作用機制

miRNA可通過兩種不同的機制來達到對靶基因的調(diào)控：mRNA剪切與翻譯抑制。近期多數(shù)研究均表明，miRNA抑制或沉默靶基因mRNA的方式，決定于其與靶基因3′非翻譯區(qū)序列互補的程度。當miRNA與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)序列完全互補時即可導致mRNA降解，當miRNA與靶基因3′非翻譯區(qū)序列不完全互補時可以導致mRNA抑制，說明miRNA與靶基因mRNA相互配對程度決定了其對靶基因調(diào)控的方式。由于多數(shù)miRNA與靶基因mRNA完全互補程度并不高，目前發(fā)現(xiàn)miRNA對靶mRNA的主要作用方式主要是抑制作用。同時miRNA也可上調(diào)靶基因的表達，從而對靶基因起到正性調(diào)控作用。研究表明大約40%～90%編碼蛋白的基因3′非翻譯區(qū)均存在miRNA靶作用點［4］，目前認為人類基因組中有1 048條miRNA［5］，而人類30%～40%的基因在翻譯水平受miRNA的調(diào)控［6］。單個miRNA可以有多個靶基因mRNA，單個基因也可以被多個miRNA調(diào)控［7］。

miRNA的靶mRNA主要是細胞生物學過程中的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)因子、生長因子等，研究miRNA的功能主要通過研究其與靶基因的關(guān)系，其作用機制為miRNA 5′端的種子區(qū)與其靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合，說明只要找到細胞中miRNA的靶mRNA，就可以研究細胞中該miRNA的作用，靶基因的確定至關(guān)重要。由于miRNA及其靶基因mRNA序列在物種間具有高度保守性，這為miRNA的預測奠定了基礎(chǔ)。目前研究miRNA-靶mRNA之間相互作用的方法包括：靶基因預測軟件預測、熒光素酶報告基因檢測、構(gòu)建載體上調(diào)miRNA的表達和下調(diào)miRNA的表達檢測目標mRNA。其中利用表達譜分析和生物信息學方法預測靶基因為miRNA功能研究提供大量線索。利用生物信息學技術(shù)用計算機軟件預測靶mRNA后，還需通過蛋白基因組學實驗研究來驗證靶基因的可靠性。根據(jù)miRNA調(diào)控機制的不同，實驗研究驗證分為兩個方面：通過對降解產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄和克隆測序可以完成對靶基因mRNA降解作用的驗證。對于翻譯抑制機制，需要采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，構(gòu)建載體上調(diào)和下調(diào)miRNA對靶mRNA進行雙熒光驗證、蛋白組學分析。

2 miRNA調(diào)控BMSCs成骨分化

成骨細胞來源于骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）［8］，即決定骨形成的成骨細胞由BMSCs分化成熟而來，BMSCs的數(shù)量和成骨分化功能直接影響成骨細胞的數(shù)量和功能活性，因此BMSCs向成骨細胞分化對維持骨穩(wěn)態(tài)非常重要。那么miRNA在BMSCs向成骨細胞分化中有何作用呢？2008年，Kobayashis發(fā)現(xiàn)在敲除了小鼠的內(nèi)切核酸酶Dicer后，小鼠BMSCs成骨分化功能消失［9］。小鼠軟骨細胞數(shù)量明顯減少，軟骨生成減少，密度下降。Dicer是miRNA合成所必需的一個內(nèi)切酶，說明miRNA在骨形成和發(fā)育中有重要作用［10］。BMSCs的增殖活性與成骨分化過程均與miRNA密切相關(guān)。BMSCs成骨分化過程涉及多條信號通路，如BMP信號通路、Wnt信號通路、TGF-β通路、Notch信號通路等［11］。一般來說miRNA對基因進行負性調(diào)控，因此miRNA對成骨分化的作用可以是作用于促進成骨的基因而抑制成骨，也可以是作用于抑制成骨作用的基因，從而間接地對成骨進行正性調(diào)控［12］。

2.1促進成骨分化的miRNA

Li Z等［13］發(fā)現(xiàn)在MC3T3細胞成骨分化過程中，miR-29b可以通過作用于抑制成骨的靶基因HDAC4、TGF-β3、ACVR2A，通過降解作用，阻止其表達，從而促進成骨。此外還有研究發(fā)現(xiàn)miR-29a通過抑制DKK1來激活WNT通路，通過與WNT通路形成循環(huán)來促進成骨分化［14］。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-27可以抑制靶基因APC，從而反激活WNT促進成骨分化［15］。Liu Y等［16］認為miR-17可能通過抑制牙周膜間充質(zhì)干細胞成骨分化的負性調(diào)控因子Smurf1，從而促進牙周膜間充質(zhì)干細胞的成骨分化。He J等［17］發(fā)現(xiàn)miR-20b通過與其靶基因PPARγ結(jié)合，降低PPARγ的表達，從而提高了成骨核心轉(zhuǎn)錄因子Runx2轉(zhuǎn)錄，促進成骨分化。該研究認為PPARγ通過促進成酯分化，抑制成骨分化的轉(zhuǎn)錄因子。Zhou Q等［18］用伊班磷酸鈉干預牙周膜間充質(zhì)干細胞后發(fā)現(xiàn)，miR-18及相關(guān)成骨轉(zhuǎn)錄因子表達上升，表明miR-18可能在伊班磷酸鈉促進牙周膜間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中起到正性調(diào)控作用。miR-210在ST2成骨分化過程中可能通過沉默抑制成骨分化的重要基因AcvR1b來促進成骨，過表達miR-210后堿性磷酸酶、成骨核心結(jié)合因子Runx2的表達上升［19］。

2.2抑制成骨分化的miRNA

Wei J等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-34b和miR-34c作為miR-34家族的2個成員通過兩條途徑來實現(xiàn)抑制成骨的作用，一方面CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白積累等被miR-34b和miR-34c所阻礙，從而抑制了成骨細胞的數(shù)量；另一方面SATB2蛋白的表達降低從而抑制成骨細胞的分化。Li Z等［21］發(fā)現(xiàn)在BMP2誘導的C2C12細胞成骨分化中，對其中顯著下調(diào)的miR-133和miR-135進行研究后發(fā)現(xiàn)，miR-133的靶基因為Runx2，而miR-135的靶基因為Smad5，兩者共同作用來抑制骨的形成。那么在臨床上可以通過降低miR-133和miR-135的表達來促進成骨作用，最終達到改善骨重建的作用。Wang X等［22］研究發(fā)現(xiàn)老年骨折患者的骨組織中高表達miR-214，miR-214是通過作用于活化轉(zhuǎn)錄因子4ATF4來降低成骨作用的。在動物實驗中miR-214也被證實具有抑制成骨細胞活性的作用。Eskildscn T等［23］發(fā)現(xiàn)miR-138可以直接作用于成簇黏附激酶FAK，抑制FAK-ERK1/2信號通路，從而降低下游成骨核心結(jié)合因子Runx2和OSX的表達來降低成骨作用。同樣，在人骨髓間充質(zhì)干細胞中過表達miR-138后骨形成下降，低表達miR-138后成骨作用增加。Zeng Y等［24］發(fā)現(xiàn)miR-100抑制干細胞成骨分化，該作用通過降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體BMP-2來實現(xiàn)。Gao J［25］分離培養(yǎng)人的BMSCs后在成骨分化過程中篩選分化前后miRNA差異最大的hsa-miR-31、hsa-miR-106a、hsa-miR-148a，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA可能通過成骨核心結(jié)合因子Runx2、CBFB和BMPs起作用。Schaap-Oziemlak A M等［26］發(fā)現(xiàn)hsa-miR-135b可能作用于IBPS和Osterix，在無限成體干細胞（USSCs）中顯著下調(diào)。同樣miR-637在間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化中表達也降低，可能也是通過靶基因Osterix起作用的。

3展　望

研究證實miRNA幾乎參與了生物學行為中所有的基因調(diào)控通路，具有極強的調(diào)控作用。miRNA對干細胞自我更新和分化調(diào)控機制是必須要明確的，也是目前科學家正在努力研究的熱點課題。生物，包括人類，在對環(huán)境適應及進化過程中伴隨著頻繁而持續(xù)的基因—基因和基因—環(huán)境相互作用，miRNA的高度保守性決定了其非常適合研究基因—基因和基因—環(huán)境相互作用。針對某種特殊疾病的病理，可能對某些特定表型具有陽性或陰性效應的miRNA基因，用生理及遺傳病理模型評估陽性miRNA與蛋白編碼基因潛在作用靶點的關(guān)系，從而用于疾病的診斷與治療，可能將成為未來基因與疾病研究的熱點，miRNA基因效應的分子生理學認識可能會帶來直達作用靶點的治療。

在一些增齡性疾病如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）的研究中，經(jīng)過生物信息學預測及基因芯片的篩選，發(fā)現(xiàn)某些特定的miRNA可能控制著BMSCs向成骨細胞分化，這些miRNA通過降低或提高成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來抑制或促進BMSCs的成骨分化過程。越來越多的證據(jù)顯示，某些miRNA調(diào)控作用具有高度保守性，在進化過程中以及不同物種間還保持完整的作用?？梢酝ㄟ^檢測絕經(jīng)前后患者骨組織或血液、體液中的特異基因miRNA，由此來進行PMOP的診斷。而進一步發(fā)展和調(diào)整miRNA干擾載體，使它能在BMSCs成骨分化中起到促進成骨作用，從而預防和治療PMOP，這將是一種全新的PMOP診治模式。但成骨過程中有多少特異性miRNA參與對BMSCs生物學行為調(diào)控?這些特異性miRNA又如何調(diào)控促進代謝性骨病的發(fā)生？能否通過降低或提高特異性miRNA改變BMSCs的生物學特性？有待于我們進一步研究。

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（編輯：梁葆朱）

中圖分類號：Q522

文獻標識碼：A

文章編號：1671-0258（2016）02-0060-03

［基金項目］國家自然科學基金項目（81173282）

［作者簡介］張文明，在讀博士，E-mail：393390125@qq.com

［通訊作者］林燕萍，教授，博士研究生導師，E-mail：lyp66@126.com