分子生物學(xué)技術(shù)在胃腸道微生物研究中的應(yīng)用

湯文杰，唐　凌，張　純，鄺聲耀*（四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川省飼料科技研發(fā)中心，四川 成都 610066）

分子生物學(xué)技術(shù)在胃腸道微生物研究中的應(yīng)用

湯文杰，唐凌，張純，鄺聲耀*
（四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川省飼料科技研發(fā)中心，四川 成都 610066）

摘要：本文論述了末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RLFP）技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)、基因芯片（Gene chip）技術(shù)及高通量測(cè)序（HTS）技術(shù)等多種分子生物學(xué)技術(shù)在胃腸道菌群研究方面的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：胃腸道微生物；末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；變性梯度凝膠電泳；熒光原位雜交；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；基因芯片；高通量測(cè)序

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟與發(fā)展，動(dòng)物胃腸道微生物研究技術(shù)步入了一個(gè)新的階段?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)無(wú)論從質(zhì)量上還是數(shù)量上都能更加精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)技術(shù)在動(dòng)物胃腸道微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1　分子生物學(xué)研究方法

1.1末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RLFP）技術(shù)T-RFLP技術(shù)以分子系統(tǒng)學(xué)原理為基礎(chǔ)，綜合運(yùn)用了PCR、限制性酶切、熒光標(biāo)記和DNA序列分析等技術(shù)，通過(guò)對(duì)特定核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性的測(cè)定來(lái)分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。T-RFLP的原理：采用一端熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)16S rRNA基因，然后用合適的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度特征的限制性片段。酶切后的產(chǎn)物用DNA測(cè)序儀進(jìn)行分析，通過(guò)掃描得到含有熒光標(biāo)記的片段，而沒(méi)有標(biāo)記熒光的片段無(wú)法識(shí)別，所以不能顯示，最后通過(guò)分析，揭示樣品種類、數(shù)量和種群大小等信息，從而解析群落結(jié)構(gòu)、功能及動(dòng)態(tài)變化。雖然該技術(shù)已被證明是一種監(jiān)測(cè)胃腸道微生物群落的有用的指紋圖譜技術(shù)，但是仍然存在局限性：（1）擺脫不了PCR技術(shù)共同的缺陷，如不同菌種DNA的差異性擴(kuò)增，以及目標(biāo)DNA在菌種間拷貝數(shù)的差異等；（2）T-RFLP圖譜中每個(gè)TRF有可能不只對(duì)應(yīng)一個(gè)菌種，造成對(duì)群落多樣性的低估；（3）酶切后TRF的長(zhǎng)度分布也會(huì)造成對(duì)復(fù)雜群落多樣性的低估，因?yàn)闇y(cè)序儀檢測(cè)500bp以上的TRF的精度不夠；（4）實(shí)驗(yàn)過(guò)程影響因素眾多，使得T-RFLP圖譜的解析存在一定的不確定性；（5）在如何對(duì)大量T-RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以挖掘出其中的群落結(jié)構(gòu)信息方面，很多理論和技術(shù)上的問(wèn)題仍處于摸索階段。

1.2變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)DGGE技術(shù)的原理：堿基序列存在差異的不同等長(zhǎng)DNA在同一含有變性劑的凝膠中進(jìn)行電泳，會(huì)表現(xiàn)不同的電泳速度，因此通過(guò)對(duì)DNA染色可將不同的DNA區(qū)分開。DGGE技術(shù)一直不斷的發(fā)展，隨后出現(xiàn)了溫度梯度凝膠電泳（TGGE）技術(shù)、瞬時(shí)溫度梯度凝膠電泳（TTGE）技術(shù)等，DGGE及其相關(guān)技術(shù)已被應(yīng)用到人類、豬、牛、狗和嚙齒動(dòng)物等物種的微生物生態(tài)系統(tǒng)研究上，揭示了動(dòng)物年齡、日糧成分、益生菌以及抗生素對(duì)腸道細(xì)菌群體的影響。DGGE作為一種分子生物學(xué)技術(shù)，除擁有多數(shù)分子生物學(xué)技術(shù)所共有的缺點(diǎn)外（即PCR過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生偏差），還有一些自身的缺陷：（1）DGGE只能分離1 000 bp以下的DNA片段，只能夠提供有限的系統(tǒng)發(fā)育信息；（2）如果實(shí)驗(yàn)條件不恰當(dāng)，梯度不合適，會(huì)使序列不同的DNA遷移到膠的同一位置；（3）PCR-DGGE的指紋圖譜上通常僅顯示微生物群落中的優(yōu)勢(shì)種群，所以只能對(duì)菌體數(shù)量大于總菌量1%的菌群進(jìn)行分析。雖然DGGE技術(shù)存在不少缺點(diǎn)，但它可直接利用DNA或者RNA對(duì)微生物遺傳特征進(jìn)行表征，不但避免了傳統(tǒng)上耗時(shí)的菌種分離，直接再現(xiàn)微生物群落的遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)性，更可與16S rDNA基因序列分析結(jié)合，鑒定出無(wú)法利用傳統(tǒng)方法分離的菌種，因而成為胃腸道微生物研究的新寵。

1.3熒光原位雜交（FISH）技術(shù)FISH技術(shù)的原理：根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，從而檢測(cè)該特異微生物種群的存在與豐度。FISH相對(duì)其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需培養(yǎng)和核酸提取、PCR擴(kuò)增等程序，能夠定量和自動(dòng)化，可以描述微生物的形態(tài)特征、豐度以及在樣品上的空間分布和動(dòng)態(tài)。目前，研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)出許多不同細(xì)菌的特異性探針。應(yīng)用此技術(shù)，一組15個(gè)的FISH探針就能夠檢測(cè)到約90%的人類常規(guī)腸道微生物。實(shí)際上，F(xiàn)ISH技術(shù)仍然存在一些不足：（1）從研究對(duì)象來(lái)看，F(xiàn)ISH技術(shù)只能面向已知序列的微生物進(jìn)行研究；（2）細(xì)菌普遍存在自發(fā)熒光現(xiàn)象且靈敏度較低，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。所以，F(xiàn)ISH技術(shù)還需要與其他分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合使用，才能達(dá)到更好的效果。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)RT-PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，通過(guò)RTPCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。由于該方法高效、準(zhǔn)確的定量特性，目前已成功用于對(duì)人類、仔豬腸道及反芻動(dòng)物瘤胃中某些特定菌群的定量分析。RT-PCR技術(shù)延續(xù)和發(fā)展了普通PCR的敏感性和特異性，同時(shí)克服了普通PCR不能精確定量、容易污染的不足。當(dāng)然，RT-PCR尚存在一些不足之處：（1）熒光素種類及檢測(cè)光源的局限性會(huì)不同程度地限制RT-PCR的復(fù)合式檢測(cè)應(yīng)用能力；（2）該技術(shù)只能對(duì)少數(shù)目標(biāo)種類進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于研究復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，此技術(shù)便非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因?yàn)槊糠N細(xì)菌都需要特定的引物與PCR擴(kuò)增條件。目前，在豬的腸道微生物研究方面，研究者已經(jīng)設(shè)計(jì)了各種引物能夠?qū)偧?xì)菌、乳酸菌、鏈球菌和雙歧桿菌等進(jìn)行定量檢測(cè)。所以，用該技術(shù)對(duì)腸道菌群進(jìn)行研究時(shí)，還需要與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從而定性、定量地研究微生物區(qū)系的變化，深入了解微生物菌群與環(huán)境之間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，為全面、快速、準(zhǔn)確分析和鑒定復(fù)雜環(huán)境中的微生物菌群提供了一種新的技術(shù)手段。

1.5基因芯片（Gene chip）技術(shù)Gene chip技術(shù)是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量DNA探針如基因、PCR產(chǎn)物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在載體表面，形成儲(chǔ)存大量信息的高密度DNA微陣列，該微陣列與標(biāo)記的核酸樣品雜交后，能快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模地獲取樣品核酸序列信息，從而應(yīng)用于各種生態(tài)系統(tǒng)的菌群研究。Wang等較早建立了人胃腸道40種主要細(xì)菌的芯片鑒定技術(shù)，包括擬桿菌、梭菌屬、瘤胃球菌、真桿菌、梭形桿菌、乳酸桿菌、球桿菌、大腸桿菌等，發(fā)現(xiàn)其中33種細(xì)菌都能通過(guò)此方法檢測(cè)到。在研究人類結(jié)腸和胃微生物生態(tài)系統(tǒng)時(shí)，所設(shè)計(jì)芯片中的探針能檢測(cè)到359個(gè)微生物物種和316個(gè)新的OTUs。最近由Oleg等制備出的基因芯片則更為靈敏，可檢測(cè)出人類腸道中775個(gè)微生物物種。近年來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)正廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)研究。當(dāng)然，基因芯片技術(shù)研究體系仍然存在一定的提升空間，比如提高芯片的特異性、增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度，這些都可以為腸道菌群的研究提供更為廣闊的應(yīng)用前景，從而推動(dòng)該領(lǐng)域研究達(dá)到一個(gè)新的高度。

1.6高通量測(cè)序（HTS）技術(shù)HTS技術(shù)的原理：在焦磷酸測(cè)序的反應(yīng)體系中會(huì)存在4種酶，分別為DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為5′-磷酰硫酸以及熒光素，在反應(yīng)體系中還包括待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物。當(dāng)引物與模板DNA復(fù)性后，在上述4種酶的協(xié)同作用下，每一個(gè)dNTP的聚合會(huì)與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，最終以熒光信號(hào)的形式實(shí)時(shí)記錄模板DNA的核苷酸序列。隨著HTS技術(shù)的發(fā)展，宏基因組技術(shù)開始被用于研究人類及動(dòng)物胃腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。2006年，Gill等首次對(duì)兩個(gè)健康人的微生物宏基因組進(jìn)行了比較，并提出了“Superorganism”概念。Ziemer取豬糞便，加纖維素、果膠木聚糖連續(xù)培養(yǎng)8周后，利用基于高通量測(cè)序的宏基因組技術(shù)得到575種細(xì)菌菌株，與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，約有30%的細(xì)菌為不可培養(yǎng)菌，有179株屬于新的菌種或菌屬。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)動(dòng)物腸道微生物進(jìn)行測(cè)序，然后比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，可準(zhǔn)確獲得腸道微生物群落的分類、豐度信息，確定這些腸道微生物的主要功能，為后續(xù)動(dòng)物腸道研究提供支持。

雖然高通量測(cè)序技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)研究方法而言在獲得微生物數(shù)據(jù)量、可操作性等方面具有很大進(jìn)步，但仍不夠完善。比如，現(xiàn)在的高通量測(cè)序技術(shù)都是將DNA剪切為小片段后，再單個(gè)連接至一定的固相表面單獨(dú)擴(kuò)增后拼接并檢測(cè)信號(hào)，DNA拼接越長(zhǎng)難度越大，因而難以完全控制完美的片段閾值，存在一定的誤差。另一方面，高通量測(cè)序越來(lái)越強(qiáng)的測(cè)序深度及越來(lái)越大的數(shù)據(jù)輸出也導(dǎo)致現(xiàn)有算法難以完全利用如此龐大的數(shù)據(jù)量，不但造成數(shù)據(jù)的浪費(fèi)且在一定程度上制約了高通量測(cè)序技術(shù)在宏基因組學(xué)方面的應(yīng)用。此外，該方法的費(fèi)用非常高。不可否認(rèn)，高通量測(cè)序技術(shù)第一次使人類得以研究占環(huán)境中99%的不可培養(yǎng)的微生物種群，進(jìn)一步拓展了人類研究腸道菌群的深度和廣度，但該方法的費(fèi)用不菲，不利于廣泛推廣。

2　分子生物學(xué)方法存在的問(wèn)題

分子生物學(xué)方法較傳統(tǒng)方法有不可替代的優(yōu)勢(shì)，但也存在著許多問(wèn)題：

2.1樣品保存問(wèn)題環(huán)境樣品在提取核酸前的厭氧和常溫存放不可避免地導(dǎo)致樣品中微生物發(fā)生變化，冷凍可以減緩變化過(guò)程，但是存放時(shí)間也不可以過(guò)長(zhǎng)，某些微生物在0～4℃仍然可以觀測(cè)到明顯的生長(zhǎng)現(xiàn)象。

2.2樣品DNA的質(zhì)量問(wèn)題一般糞便樣品中除腸道微生物外，還有腐殖質(zhì)、動(dòng)物腸道脫落細(xì)胞及碎片、各種無(wú)機(jī)物和有機(jī)物等，如何獲取高質(zhì)量、較完整的腸道菌群基因組DNA是腸道微生物研究的基礎(chǔ)。

2.3DNA純化問(wèn)題微生物與環(huán)境中的有機(jī)物結(jié)合緊密，對(duì)高效率提取核酸造成了困難；樣品中存在的腐殖酸對(duì)DNA的檢測(cè)和定量也有很大的影響，主要表現(xiàn)在抑制DNA高溫聚合酶的活性，干擾限制酶的結(jié)合位點(diǎn)，降低轉(zhuǎn)化效率以及DNA雜交的特異性。

3　小結(jié)

分子生物學(xué)方法可以讓我們更深入地了解腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)、多樣性和功能等，由于每種研究微生物的技術(shù)都有一定的優(yōu)勢(shì)和局限性，故實(shí)際研究過(guò)程中經(jīng)常采取多種方法相結(jié)合的手段?！?/p>

參考文獻(xiàn)：

［1］AlexanderS，AxelL，Annelie P，et al.Mucosal flora in inflammatory bowel disease［J］.Gastroenterology，2002，122（1）：44-54.

［2］Endo A，F(xiàn)utagawa-Endo Y，Dicks L M T.Lactobacillus and bifidobacterium diversity in horse feces，revealedbyPCR-DGGE［J］.Current Microbiology，2009，59（6）：651-655.

［3］戈海澤，梁慧敏，盧晉英，等.基因芯片技術(shù)在常見(jiàn)腸道致病菌感染檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（4）：24-26.

［4］Kurokawa K，Itoh T，Kuwahara T，et al.Comparativemetagenomicsrevealedcommonlyenriched gene setsinhumangut microbiomes［J］.DNA Research，2007，14（4）：169-181.

［5］Singh K M，Shah T M，Reddy B，et al.Taxonomic and gene-centric metagenomics of the fecal microbiome of low and high feed conversion ratio（FCR）broilers［J］.Journal of Applied Genetics，2014，55（1）：145-154.

［6］Yanfei C，F(xiàn)engling Y，Haifeng L，et al.Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis［J］.Hepatology，2011，54（2）：562-572.

［7］Ziemer C J.Newly cultured bacteria with broad diversity isolated from eight-week continuous culture enrichments of cow feces on complex polysaccharides［J］.Applied&Environmental Microbiology，2014，80（2）：574-585.

中圖分類號(hào)：S818.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-8964（2016）06-0027-03

收稿日期：2016-02-24

基金項(xiàng)目：四川省公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（SASA2013A05）

作者簡(jiǎn)介：湯文杰（1984-），男，四川南充人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究與飼料添加劑開發(fā)。

*通訊作者：鄺聲耀，研究員。

Application of Molecular Biological Technology in the Study of Gastrointestinal Microflora

TANG Wenjie，TANG Ling，ZHANG Chun，et al.
（Institute of Animal Nutrition，Sichuan Animal Science Academy，Sichuan Feed Scientific Research and Development Center，Sichuan Chengdu 610066，China）

Abstract：This paper focused on the application of some modern molecular biotechnology in the study of gastrointestinal microorganism，including terminal-restriction fragment length polymorphism（T-RFLP），denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE），fluorescence in situ hybridization（FISH），real-time polymerase chain reaction（RT-PCR），gene chip and high-throughput sequencing（HTS）technology etc.

Key Words：Gastrointestinal microflora；T-RLFP；DGGE；FISH；RT-PCR；Gene chip；HTS